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两种苹果酸脱氢酶的克隆、表达及酶学分析
作 者: 陈露露
导 师: 朱国萍
学 校: 安徽师范大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 茶树 变铅青链霉菌TK54 苹果酸脱氢酶 RT-PCR cDNA末端快速扩增法 序列分析 酶学性质
分类号: Q946.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)广泛存在于自然界当中,负责催化苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换,在细胞的多种生理活动中发挥重要作用,如C4循环、光合作用、TCA循环。高等植物中根据辅酶特异性、亚细胞定位以及生物学功能的不同,植物苹果酸脱氢酶可以分为五种类型:叶绿体依赖NADP的MDH(Chloroplast NADP-dependent MDH,chMDH)、线粒体依赖NAD的MDH(Mitochondrial NAD-dependent MDH,mMDH)、微体依赖NAD的MDH(Microbody NAD-dependent MDH)、叶绿体依赖NAD的MDH(Chloroplast NAD-dependent MDH,cnMDH)以及细胞质依赖NAD的MDH(Cytosolic NAD-dependent MDH,cMDH)其中胞质型苹果酸脱氢酶在高等植物中尚未得到广泛研究。利用RT-PCR及cDNA末端快速扩增法,获得了完整的茶树细胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)基因Cs-cMDH (GenBank登录号为GQ845406)。该基因全长1235 bp,编码332个氨基酸,分子量约为35.5 kDa。含重组质粒pGEX-MDH的E. coli Rosetta经0.5 mM IPTG于32℃诱导3 h后可以获得大量可溶性的61.5 kDa融合蛋白。NCBI的BLAST结果显示,Cs-cMDH与高等植物cMDH的氨基酸序列一致性高达88~93%。通过基于蛋白质结构的多序列比对,预测Cs-cMDH为二聚体,每个亚基包含13个β-折叠及13个α-螺旋。Cs-cMDH包含典型的MDH“指纹”(fingerprint)序列G12AAGQIG18,其氨基酸残基D43在所有NAD-MDH中都很保守。Cs-cMDH还包含一些与其它NAD-MDHs同源的保守序列单元,如NAD+结合位点、催化模体及底物结合位点。而且Cs-cMDH还包含在所有植物NAD-cMDHs中都相当保守的6个Cys。因此我们推断Cs-cMDH为茶树细胞质NAD-MDH。茶树基础代谢相关基因cMDH的克隆和原核表达为Cs-cMDH的功能研究奠定了基础。以Streptomyces lividans TK54基因组DNA为模板扩增出苹果酸脱氢酶基因(GenBank登录号为EU715400),包含一个990bp的开放阅读框。序列同源性分析表明S. lividans TK54的MDH(SlMDH)与其他物种的细胞质MDH有较高的同源性。将SlMDH基因克隆入pET-28(b)表达系统,实现了其在大肠杆菌中的异源表达。蛋白质凝胶电泳分析显示重组蛋白的分子量约为35.5 kDa。对纯化后的MDH酶学性质进行了初步研究,结果显示重组蛋白SlMDH的最适反应温度为45℃,最适反应pH为8.0。重组蛋白对辅酶NADH和底物草酰乙酸的动力学常数Km分别为26.0μM和79.3μM,kcat分别为1850 s-1和3280 s-1。此外,该重组蛋白对草酰乙酸无底物抑制性,金属离子对它的影响也不明显。
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全文目录
摘要 5-7 Abstract 7-11 第一章 综述 11-26 1 苹果酸脱氢酶研究进展 11-16 2 茶树新基因的研究现状 16 3 链霉菌简介 16-18 4 研究意义和展望 18-21 参考文献 21-26 第二章 茶树胞质型苹果酸脱氢酶基因(Cs-cMDH)的克隆及原核表达 26-47 1 材料和方法 26-34 1.1 材料与试剂 26-27 1.2 总RNA 的提取与cDNA 的获得 27-28 1.3 Cs-cMDH 基因保守片段的扩增 28-29 1.4 Cs-cMDH 基因的5′RACE 和3′RACE 29-30 1.5 Cs-cMDH 基因全长cDNA 的获得 30-31 1.6 Cs-cMDH 基因的异源表达 31-34 1.7 Cs-cMDH 的氨基酸序列及理化性质分析 34 1.8 Cs-cMDH 的氨基酸序列分析及结构预测 34 2 结果与分析 34-42 2.1 茶树总RNA 的提取 34 2.2 全长Cs-cMDH 基因的获得 34-36 2.3 Cs-cMDH 的异源表达 36-38 2.4 Cs-cMDH 的氨基酸序列及理化性质分析 38-42 2.5 基于结构的Cs-cMDH 二级结构及3D 预测 42 3 讨论 42-44 参考文献 44-47 第三章 变铅青链霉菌TK54 苹果酸脱氢酶的表达、纯化及酶动力学研究 47-64 1 材料和方法 47-53 1.1 材料与试剂 47-48 1.2 SlMDH 基因的扩增 48-49 1.3 目的基因的纯化和pET-SlMDH 重组质粒的获得 49 1.4 SlMDH 的表达与纯化 49-50 1.5 纯化蛋白浓度的测定 50 1.6 Western blot 分析及SlMDH 分子量的测定 50-51 1.7 酶动力学参数的分析 51-53 2 结果与分析 53-60 2.1 SlMDH 基因的扩增 53-54 2.2 重组质粒pET-SlMDH 的获得和鉴定 54 2.3 SlMDH 的表达和纯化 54-55 2.4 SlMDH 的酶学性质 55-60 3 讨论 60-62 参考文献 62-64 致谢 64-65 附:本人在读期间发表论文、申请专利以及获奖情况一览表 65
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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学 > 酶
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