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纤维素酶产生菌的选育、发酵产酶条件及酶学性质的研究

作　者: 武香玉
导　师: 陈存社
学　校: 北京工商大学
专　业: 食品科学
关键词: 纤维素降解菌筛选纤维素酶发酵条件酶学性质
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本论文对纤维素降解菌的筛选、液体发酵及固体发酵产酶条件、发酵产物分析及扩大培养、纤维素酶的酶学性质及直投式发酵剂的制备等方面进行了研究,主要内容和结论如下:以土壤为分离源,通过刚果红平板初筛、摇瓶发酵测酶活方法复筛,筛选到产酶性能良好的菌株3-7和W13。采用菌体形态观察、生理生化特性分析并结合基因序列分析方法对菌株分类鉴定,最终3-7确定为绿色木霉(Trichoderma viride),W13确定为巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)。通过单因素实验以及正交实验,优化了两株菌的液体发酵产酶条件。菌株3-7最优发酵条件为:以1.5% CMC-Na为碳源,1.5%酵母膏作氮源,添加0.4% NaCl,0.05% MgSO4·7H2O,0.4% KH2PO4,0.03% CaCl2,培养基初始pH为5,26℃条件下培养4d。菌株W13最佳发酵条件为:以1.5% CMC-Na为碳源,5%酵母膏作氮源,添加0.2% NaCl,0.05% MgSO4·7H2O,0.4% KH2PO4,0.03% CaCl2,培养基初始pH为6,37℃培养4d。研究了两株菌固体发酵碳氮源、料水比、温度等因素对产酶的影响。菌株3-7最优发酵条件为:酒糟︰麸皮=7︰3,1%大豆粉,料水比1︰1,pH自然,孢子悬液接种量为0.5ml,30℃培养3d,CMC酶活和FPA酶活分别达到7105.92U/g和1463.97 U/g。菌株W13的最佳发酵条件为:酒糟︰麸皮=7︰3,2%大豆粉,料水比为1︰3,pH为7,接种量为1.5ml,37℃培养4d,CMC酶活和FPA酶活分别达到397.29 U/g和270.64 U/g。在固体发酵基础上对菌株3-7的发酵产物进行了分析,粗纤维降解率达34.62%,粗蛋白含量有所提高,粗脂肪与灰分变化并不显著。酶系分析表明,发酵产物含有纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和酸性蛋白酶。通过发酵罐培养初步探索了纤维素酶的扩大培养,CMC酶活仅为1301.57U/g,FPA酶活为470.75 U/g。对菌株的酶学性质进行了研究。菌株3-7 CMCase和FPA最适反应温度分别为50℃和60℃,最适反应pH为4.6和4.8。在低于50℃条件下处理2h两种酶的相对酶活力均能保持93%以上,在pH 4.6-5.4范围内于4℃放置24h相对酶活力都能保持在90%以上。Cu~2+和Ca~2+对产酶有促进作用,Fe~2+和Mn~2+有抑制作用,Zn~2+、Mg~2+、K~+、Na+影响作用不明显。菌株W13 CMCase和FPA最适反应温度分别为60℃和55℃;最适反应pH均为5.8;在35℃-55℃处理2两种酶都能保持90%以上的酶活力;在pH 5.2-6.0于4℃放置24h酶活力保持90%以上。Mg~2+和Cu~2+能促进产酶,Ca~2+、Fe~2+、Mn~2+、Zn~2+、K~+、Na~+对产酶有较强抑制作用。研究了菌株3-7的直投式发酵剂的制备中干燥方法、保护剂等的选择及对发酵性能的影响,以20%蔗糖作保护剂、采用真空冷冻干燥法(不经预冻)条件下CMC及FPA酶活分别达到5861.98 U/g、1198.80 U/g。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第一章绪论  11-18
  1.1 纤维素简介  11-12
  1.2 纤维素酶简介  12-16
    1.2.1 纤维素酶的组成  12-13
    1.2.2 纤维素酶的作用机理  13-14
    1.2.3 产纤维素酶的微生物  14
    1.2.4 纤维素酶的生产  14-15
    1.2.5 纤维素酶的应用  15-16
    1.2.6 纤维素酶研究展望  16
  1.3 研究意义及研究内容  16-18
    1.3.1 研究意义  16-17
    1.3.2 研究内容  17-18
第二章纤维素降解菌的分离鉴定  18-35
  2.1 引言  18
  2.2 材料与方法  18-25
    2.2.1 分离源  18
    2.2.2 主要试剂  18-19
    2.2.3 培养基  19
    2.2.4 主要溶液  19-20
    2.2.5 主要仪器  20
    2.2.6 菌种分离方法  20-21
    2.2.7 酶活的测定  21-22
    2.2.8 菌种的鉴定  22-25
  2.3 结果与讨论  25-34
    2.3.1 菌种的分离与初筛  25-27
    2.3.2 菌种的复筛  27-28
    2.3.3 细菌的鉴定  28-31
    2.3.4 霉菌的鉴定  31-34
  2.4 本章小结  34-35
第三章液体发酵产纤维素酶条件的优化  35-45
  3.1 引言  35
  3.2 材料与方法  35-36
    3.2.1 菌株  35
    3.2.2 发酵产酶条件  35
    3.2.3 发酵产酶条件的优化实验  35-36
  3.3 结果与讨论  36-44
    3.3.1 不同碳源对产酶条件的影响  36-37
    3.3.2 不同氮源对产酶条件的影响  37
    3.3.3 不同pH 值对产酶条件的影响  37-38
    3.3.4 最佳温度的确定  38
    3.3.5 NaCl 比例的确定  38-39
    3.3.6 氮源比例的优化  39-40
    3.3.7 正交实验结果  40-43
    3.3.8 发酵产酶曲线  43-44
  3.4 本章小结  44-45
第四章固体发酵产纤维素酶条件的优化  45-57
  4.1 引言  45
  4.2 材料与方法  45-47
    4.2.1 菌种  45
    4.2.2 发酵原料  45
    4.2.3 培养基  45
    4.2.4 孢子悬液制备  45-46
    4.2.5 粗酶液制备  46
    4.2.6 酶活测定方法  46
    4.2.7 发酵产物分析  46-47
  4.3 结果与讨论  47-55
    4.3.1 碳源对固态发酵产酶的影响  47
    4.3.2 氮源对固态发酵的影响  47-48
    4.3.3 料水比对固态发酵的影响  48-49
    4.3.4 氮源比例对固态发酵的影响  49
    4.3.5 初始pH 值对固态发酵的影响  49-50
    4.3.6 接种量对固态发酵的影响  50-51
    4.3.7 培养温度对固态发酵的影响  51-52
    4.3.8 固体发酵的产酶进程  52-53
    4.3.9 发酵罐培养对菌株3-7 产酶的影响  53
    4.3.10 菌株3-7 发酵产物分析  53-55
  4.4 本章小结  55-57
第五章纤维素酶学性质研究  57-62
  5.1 引言  57
  5.2 材料与方法  57
    5.2.1 试剂  57
    5.2.2 菌种  57
    5.2.3 粗酶液制备  57
    5.2.4 酶活测定  57
  5.3 结果与讨论  57-61
    5.3.1 温度对纤维素酶活性的影响  57-58
    5.3.2 pH 值对纤维素酶活性的影响  58-59
    5.3.3 温度对纤维素酶稳定性的影响  59
    5.3.4 pH 值对纤维素酶稳定性的影响  59-60
    5.3.5 金属离子对纤维素酶活性的影响  60-61
  5.4 本章小结  61-62
第六章直投式发酵剂加工工艺探讨  62-67
  6.1 引言  62
  6.2 材料与方法  62-64
    6.2.1 药品与试剂  62
    6.2.2 仪器与设备  62
    6.2.3 菌种  62
    6.2.4 培养基  62
    6.2.5 保护剂  62-63
    6.2.6 粗酶液的制备  63
    6.2.7 酶活的测定  63
    6.2.8 直投式发酵剂的制备  63
    6.2.9 发酵剂的扫描电镜观察  63
    6.2.10 发酵剂的发酵试验  63-64
  6.3 结果与讨论  64-66
    6.3.1 干燥方法的确定  64
    6.3.2 保护剂的确定  64-65
    6.3.3 发酵剂的扫描电镜观察  65
    6.3.4 发酵剂的发酵性能  65-66
  6.4 本章小结  66-67
第七章结论与建议  67-69
  7.1 主要结论  67-68
  7.2 建议  68-69
参考文献  69-72
在校期间发表的学术论文  72-73
致谢  73

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