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bcl-X_L基因过表达对辐射诱发AHH1淋巴细胞凋亡的影响及调控机制的研究

作　者: 张莹
导　师: 崔玉芳
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 病理学
关键词: 放射免疫损伤细胞凋亡 Bcl-X_L 基因转染
分类号: R818.02
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

战时核弹爆炸及平时核辐射泄露意外事故中，受大剂量照射的人员在发生造血功能障碍的同时，往往伴随有严重的免疫功能低下，表现为免疫活性细胞数量减少、抗体形成抑制或紊乱、细胞因子网络调节失常。免疫系统对辐射的反应是基于参与免疫反应的细胞，发生从DNA分子损伤、重要基因突变、重排到异常功能表达等一系列变化。这种异常的免疫系统功能障碍可能延续数月、数年、甚至数十年。持续的免疫功能障碍，使病人处于对细菌、病毒等病原体和其他损伤因子的高度敏感状态，从而影响患者的生活质量，促进衰老和死亡，成为临床医生对辐射损伤治疗的棘手问题。辐射损伤使参与细胞网络调节的许多细胞因子的表达和功能发生改变，这是射线引起免疫系统生理及病理改变的分子基础，也是构成免疫系统和器官辐射损伤与修复的重要环节。因此，研究以细胞因子为中心的细胞网络调节，对揭示辐射诱发的免疫系统的病理生理改变及其机制，以及对辐射损伤的防治均具有重要意义。近几年该领域的研究表明，辐射可引起大量淋巴细胞凋亡，这是辐射诱发免疫系统损伤的一个重要因素。本实验室以往在辐射诱发的脾脏、淋巴结、外周血淋巴细胞损伤的病理机制方面进行了大量研究，获得了一些新认识和有新意的结论。bcl-2基因家族及其表达的蛋白参与了多种组织因多种因素引发的细胞凋亡的调控。其作用环节位于细胞损伤的上游，并且其许多作用点集中在线粒体水平，它们在决定细胞生死的问题上充当了重要角色。Bcl-2蛋白家族成员很多，包括了促凋亡和抗凋亡的分子，两套分子的比例决定了细胞对死亡信号的敏感性。Bcl-X_L是Bcl-2蛋白家族中重要的抗凋亡蛋白，bcl-X_L基因敲除的小鼠表现出比bcl-2敲除小鼠(几个月内死于肾衰竭)更严重的表型，胚胎13天即死亡。本实验从bcl-X_L基因入手，构建了以逆转录病毒为载体的bcl-X_L基因重组体，通过脂质体介导法将重组体导入正常人的T淋巴母细胞(即AHH1细硕十学位论文一bc‘一XL基因过表达对辐射诱发AH川淋巴细胞凋亡的影响及调控机制的研究胞)，并以与其结构相似的含增强型绿色荧光蛋白的重组体为对照，测得脂质体转染效率为28，8%。经G418筛选2一4周后，得到稳定整合的AHHI一bc卜XL细胞克隆。荧光显微镜观察到转染对照基因的AHHI细胞中荧光蛋白的表达，证明转染成功。RT-PCR验证AHHI一bcl一XL细胞中bel一XL mRNA表达量明显高于未转染细胞;Westem一Blot证明AHHI一bel一XL细胞中Bd一xL蛋白表达量也明显较未转基因的细胞为高。均表明AHHI一bcl一XL细胞为成功构建的bcl一XL基因过表达的细胞模型。经。、3、6、9、12、一5、ZoGy 6oeo一朴射线照射后，对AHHI及AHHI一bcl一xL细胞进行比较，发现:l)在0一12Gy范围内，转基因细胞照后24h的凋亡率明显低于未转基因细胞，而活存率则明显高于未转基因细胞，经SAS软件析因设计程序分析，具有显著的统计学意义。但当照射剂量大于12Gy时，由于坏死细胞的大量出现，转基因细胞的活存优势不再明显。2) FCM分析表明，相同剂量照射下，转基因细胞照后6h的凋亡率明显低于未转基因细胞。3) Rl’- pCR和W亡stem一Blot分析显示，照后AHHI一bcl一XL细胞中抗凋亡基因bcl一XL及其蛋白的表达量与对照组相比有所下降，但仍明显高于AHHI细胞;照后，促凋亡基因bax的表达量逐渐升高，但AHHI一bel一XL细胞中Bax的量均低于相同照射剂量下的未转基因细胞。4)免疫组化结果显示，照后切割活化的凋亡执行蛋白Caspase一3的表达量，AHHI一bel一XL细胞也明显低于AHHI细胞。以上结果表明be卜XL基因的转染使AHHI细胞获得了一定的凋亡抗性。bel一XL基因编码的Bcl一XL蛋白锚定于线粒体外膜，通过BH4同源区抑制了凋亡桥联蛋白APaf-1的释放;同时，Bd一XL蛋白还可以和促凋亡蛋白Bax等形成异源二聚体，拮抗其促凋亡功能，抑制细胞色素C通过(Bax)n聚合体形成的PTP孔道释放到线粒体外，这样，Aparf-l用ro一CasPase一9就不能与线粒体释放的细胞色素C结合形成有活性的凋亡复合体，使凋亡执行蛋白Caspases的级联活化受阻，从而抑制了辐射诱发的细胞凋亡的发生。

全文目录

缩略词表  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
实验设计总图  15-16
第一部分辐射诱发AHH1淋巴细胞凋亡量效关系和机制初探  16-30
  1 实验材料  16-18
  2 实验方法  18-22
    2.1 细胞分组及照射  18
    2.2 MGG染色计数细胞凋亡百分率  18-19
    2.3 MTT法检测照后细胞活存率  19
    2.4 TEM观察细胞凋亡／坏死形态学  19
    2.5 Annexin V-FITC & PI染色检测细胞凋亡和坏死  19-20
    2.6 免疫组化法检测凋亡相关蛋白表达  20
    2.7 Western-Blot检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化  20-22
  3 实验结果  22-27
  4 讨论  27-30
第二部分 bcl-X_L基因过表达细胞模型的建立  30-44
  1 实验材料  30-33
  2 实验方法  33-41
    2.1 质粒制备  33-36
    2.2 脂质体介导的质粒转染  36-37
    2.3 基因表达检测  37-40
    2.4 基因转染对细胞生物行为的影响  40-41
  3 实验结果  41-43
  4 讨论  43-44
第三部分 bcl-X_L基因过表达对辐射诱发AHH1淋巴细胞凋亡的影响及调控机制的研究  44-56
  1 实验材料  44
  2 实验方法  44-49
    2.1 细胞分组及照射  44
    2.2 MGG染色计数凋亡细胞百分率  44
    2.3 MTT法检测照后细胞活存率  44-45
    2.4 FCM检测照后细胞凋亡率  45
    2.5 RT-PCR检测照后转基因细胞中bcl-X_L基因表达  45-47
    2.6 免疫组化检测凋亡执行蛋白Caspase-3的表达  47-48
    2.7 Western-Blot检测促凋亡蛋白Bax的表达  48-49
  3 实验结果  49-52
  4 讨论  52-56
结论  56-57
参考文献  57-60
附图  60-77
文献综述  77-92
致谢  92-93
附录  93-106
  1 个人简历  93
  2 在读期间发表的论文和综述目录  93-94
  3 在读期间发表的论文全文  94-106

bcl-X_L基因过表达对辐射诱发AHH1淋巴细胞凋亡的影响及调控机制的研究

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