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产喜树碱内生真菌的分离、鉴定及生物学活性研究

作　者: 张根
导　师: 王嘉福；冉雪琴
学　校: 贵州大学
专　业: 微生物学
关键词: 喜树碱内生真菌核糖体内部转录序列细胞凋亡
分类号: S567.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 206次
引　用: 2次
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内容摘要

在贵州省喀斯特地区生长的喜树组织中筛选了80多株内生真菌，包括根，茎，叶和果实。其中地上组织的内生真菌较丰富，种类较多。80多株内生真菌经过扩大培养，分别将菌丝和发酵液用薄层层析、高效液相色谱、质谱分析，证明内生真菌株菌株S19产喜树碱。对S19进行了形态学研究，S19的产孢结构、菌落形态符合镰刀属的分类特征。进一步提取S19菌株的基因组，对其核糖体基因居间序列(ITS)进行了分析，经聚类分析表明，S19属于镰刀属的腐皮镰刀菌种。对S19发酵液所产喜树碱的产率进行了分析，结果表明，培养第四天S19产喜树碱的得率最高，喜树碱的产量为7.4±0.48μg喜树碱／g干菌丝，四天后每升菌液中喜树碱的含量为8.96±0.34毫克喜树碱。对S19所产喜树碱的生物学活性进行了研究。经观察，从S19菌株中提纯的喜树碱作用24小时可使非洲绿猴肾细胞(Vero)皱缩，细胞膜呈泡状，细胞从瓶壁大量脱落；采用荧光染色法(AO／EB)，对S19所产喜树碱引起Vero细胞的凋亡率分析证明，作用72小时，细胞的凋亡率为13％，并且S19喜树碱的作用剂量和时间与细胞的凋亡率呈线性增加关系。因此S19菌株提取的喜树碱具有使非洲绿猴。肾细胞调亡的作用。进一步对S19喜树碱致前列腺癌细胞凋亡的作用机制进行了研究。采用Caspase-3抗体经Western blot分析，表明S19感染前列腺癌细胞48小时，细胞总蛋白提取物中呈现Caspase-3阳性显色条带，分子量35KD。表明S19喜树碱致前列腺癌细胞凋亡的作用机制是通过Caspase-3途径实现的。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
1 前言  5-15
  1.1 喜树植物内生真菌的有益次生代谢产物  5
  1.2 国内外分离内生真菌的种类及其生物活性物质  5-7
  1.3 喜树碱的结构及喜树碱的药理作用机制  7-8
  1.4 凋亡过程  8-13
  1.5.研究的目的和意义  13-15
2 实验材料与方法  15-36
  2.1 实验材料  15-19
    2.1.1 试剂:  15-18
      试剂的配制:  15-18
    2.1.2 仪器:  18-19
    2.1.3 培养基的配制  19
  2.2 方法  19-36
    2.2.1 内生真菌的筛选  19-21
    2.2.2 对产喜树碱的S19菌株种属的鉴定  21-29
    2.2.3 生物学活性分析  29-36
3 结果与分析  36-46
  3.1 内生真菌的筛选  36-40
  3.2 对产喜树碱的S19菌株种属的鉴定  40-43
    3.2.1 PCR扩增结果  41-42
    3.2.2 ITS的核苷酸序列测定及分析  42-43
  3.3 生物学活性分析  43-46
    3.3.1 CPT作用Vero,PC3细胞病变  43-44
    3.3.2 内生真菌产喜树碱的致细胞凋亡作用  44-45
    3.3.3 凋亡相关基因Caspase-3表达的变化  45-46
讨论  46-49
小结  49-50
参考文献  50-55
致谢  55-56

产喜树碱内生真菌的分离、鉴定及生物学活性研究

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