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油茶种子油体蛋白基因的分离克隆及其原核表达

作　者: 仇键
导　师: 谭晓风
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 油茶种子油体蛋白 EST 基因克隆原核表达融合蛋白
分类号: S794.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

油茶是我国南方最重要的可食用木本油料树种。油茶种子油体蛋白对种子中油脂的储藏具有重要意义。近年来随着油体表达系统研究和发展，油体蛋白基因的分离克隆和表达的研究更是得到了广泛的重视。为了分离克隆油茶油体蛋白基因并将之发展成一种经济简单的蛋白表达纯化体系，我们特开展了本课题的研究。主要研究结果如下： 1)油茶种子油体蛋白的分离和鉴定以成熟油茶种子为材料，利用油体在水相中离心漂浮特性，经反复洗涤和离心分离提取油茶种子油体，并检测不同pH条件下油体的稳定性，结果显示，当pH为6.2和6.8时，油体表面电荷被中和，油体间发生聚合，由此推测油茶油体等电点约在6.5左右。对油茶油体丙酮沉淀初提物中的蛋白组分进行SDS-PAGE分析，结果显示油茶种子中两类蛋白表达量较大，分子量约为14.4kDa和18.4kDa，与本文中油茶油体蛋白基因ORF分析推测的蛋白大小相近。同时也发现了其他少量的大分子量蛋白的存在，对这些蛋白的鉴定还有待进一步的研究。 2)油茶种子油体蛋白基因的分离克隆和生物信息学分析利用EST技术、多序列比对和序列聚类等生物信息学方法分离筛选油茶种子cDNA文库中的油体蛋白基因。分离到的油茶油体蛋白家族基因可聚为5类，分别命名为：co_oleⅠ(包括A和B两个亚类)、co_oleⅡ、co_oleⅢ、co_oleⅣ和co_oleⅤ。将其与其他物种油体蛋白进行比较分析，结果表明：Co_oleⅠ、Co_oleⅣ和Co_oleⅤ属于高分子量(H)同型体，Co_oleⅡ和Co_oleⅢ属于低分子量(L)同型体。根据这些基因的ORF设计引物(分别含起始密码子和终止密码子)扩增了其基因组DNA序列，cDNA序列和基因组DNA序列的比较结果表明后者均不含有内含子，且两者也存在一定的差异。利用生物信息学方法对油茶油体蛋白结构域搜寻结果显示，油茶油体蛋白氨基酸序列中间部分存在若干跨膜结构，Co_oleⅡ的N端存在简单重复序列，Co_oleⅣ的C端含有一段转曲螺旋；理化分析结果显示油茶油体蛋白氨基酸序列中间部分均含有极强的疏水跨膜结构，两端均表现为疏水和亲水的两性区，与研究报道的油体蛋白三个结构区特性一致。二级预测结果显示油茶油体蛋白的C端含有较多的α—螺旋结构，N末端和中心疏水区以β—折叠为主，并含有

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
缩略词  8-13
1 绪言  13-31
  1.1 植物种子油体蛋白  13-20
    1.1.1 脂体与脂体相关蛋白  13-14
    1.1.2 植物种子油体化学组成与结构  14-15
    1.1.3 植物种子油体蛋白  15-19
    1.1.4 植物种子油体蛋白基因及表达  19-20
  1.2 油体蛋白融合蛋白的表达利用  20-23
    1.2.1 植物油体表达体系  20-22
    1.2.2 人工油体(AOB)重建纯化油体融合蛋白体系  22-23
  1.3 EST技术及其在基因分离克隆的应用  23-26
    1.3.1 EST的概念  23
    1.3.2 EST技术的原理和方法  23-24
    1.3.3 基于EST的基因全长cDNA分离克隆  24-25
    1.3.4 EST与基因表达谱  25-26
  1.4 油茶分子生物学研究  26-28
    1.4.1 油茶的分子标记  26-27
    1.4.2 油茶cDNA文库及EST文库构建和重要基因的分离克隆  27-28
  1.5 本项研究的目的意义  28-29
  1.6 本项研究的主要内容和技术路线  29-31
2 油茶种子油体和油体蛋白的分离鉴定  31-39
  2.1 材料与试剂  31-33
    2.1.1 材料  31
    2.1.2 主要仪器设备  31
    2.1.3 试剂与药品  31-33
  2.2 实验方法  33-34
    2.2.1 油茶种子油体蛋白的提取  33
    2.2.2 油体蛋白SDS-PAGE电泳  33
    2.2.3 油茶种子油体混浊度检测和显微观测  33-34
  2.3 结果与分析  34-37
    2.3.1 油茶种子油体形状大小  34
    2.3.2 油茶种子油体混浊度稳定性分析  34-35
    2.3.3 油茶种子油体显微观测稳定性分析  35-36
    2.3.4 油茶种子中油体蛋白分离和组分分析  36-37
  2.4 讨论与小结  37-39
    2.4.1 油体蛋白的分离  37
    2.4.2 油体蛋白的带电性和等电点  37-38
    2.4.3 油体表面蛋白的组成  38-39
3 油茶种子油体蛋白基因的分离和生物信息学分析  39-69
  3.1 材料与试剂  39-41
    3.1.1 材料  39-40
    3.1.2 主要仪器设备  40
    3.1.3 试剂与溶液  40-41
  3.2 实验方法  41-45
    3.2.1 油茶种子 Oleosin基因cDNA序列分离  41-42
    3.2.2 油茶种子 Oleosin基因组DNA序列的分离克隆  42-45
    3.2.3 油茶中油体蛋白 Oleosin基因家族生物信息学分析  45
  3.3 结果与分析  45-65
    3.3.1 EST序列 BlastN结果分析  45-50
    3.3.2 油茶 Oleosin候选基因的氨基酸序列比对聚类分析  50-51
    3.3.3 重组子克隆插入片断的鉴定  51
    3.3.4 油茶种子油体蛋白基因cDNA序列的获得  51-52
    3.3.5 油茶油体蛋白基因的命名和序列分析  52-57
    3.3.6 油茶种子油体蛋白家族 H和 L同型体分类与序列分析  57-61
    3.3.7 油茶种子油体蛋白基因表达谱分析  61-62
    3.3.8 油茶种子油体蛋白家族进化树分析  62-63
    3.3.9 油茶油体蛋白序列结构域特点  63-64
    3.3.10 油茶油体蛋白序列的理化分析和结构分析  64-65
  3.4 讨论与小结  65-69
    3.4.1 油体蛋白基因家族的命名  65
    3.4.2 油茶油体蛋白及其基因的序列特征  65-66
    3.4.3 油茶油体蛋白的分类及其氨基酸序列相似性  66-67
    3.4.4 油茶种子油体蛋白的表达  67
    3.4.5 油茶油体蛋白的系统进化  67-68
    3.4.6 油茶油体蛋白结构特点  68-69
4 油茶种子油体蛋白的原核表达和油体表达体系研究  69-79
  4.1 材料与试剂  69-71
    4.1.1 材料  69-70
    4.1.2 主要仪器设备  70
    4.1.3 试剂与药品  70-71
  4.2 实验方法  71-74
    4.2.1 Oleosin原核融合蛋白表达和分离纯化体系的原理  71-72
    4.2.2 表达载体的构建  72-73
    4.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(大量)、转化及重组子的鉴定  73-74
    4.2.4 油体蛋白在大肠杆菌中的诱导表达  74
    4.2.5 油体蛋白在大肠杆菌中的诱导条件优化  74
  4.3 结果与分析  74-78
    4.3.1 油茶 Oleosin I插入序列分析  74-75
    4.3.2 表达载体的构建及鉴定  75-76
    4.3.3 转化大肠杆菌的诱导表达  76-77
    4.3.4 IPTG诱导条件的优化  77-78
  4.4 讨论与小结  78-79
    4.4.1 pET-30b-Co_oleIA的构建和油体蛋白的表达  78
    4.4.2 Oleosin融合蛋白原核表达体系特点  78-79
5 结论与创新  79-80
  5.1 结论  79
  5.2 创新  79-80
参考文献  80-90
附录 A  90-104
  A.1 油茶种子油体蛋白基因的核酸序列和推导氨基酸序列  90-92
  A.2 油茶油体蛋白基因组序列分析  92-95
  A.3 油茶油体蛋白基因推导氨基酸序列的理化分析和二级结构预测  95-96
  A.4 重组表达质粒载体图谱和测序检测  96-99
  A.5 油茶油体蛋白基因序列GenBank提交  99-104
附录B  104-105
致谢  105

油茶种子油体蛋白基因的分离克隆及其原核表达

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