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丁香假单胞菌番茄变种DC3000HrpA蛋白单链抗体的制备与分析
作 者: 张新艳
导 师: 王宗华
学 校: 福建农林大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: HrpA蛋白 hrP基因 单链抗体 工程抗体 噬菌体展示
分类号: S432.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2006年
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内容摘要
Hrp(hypersensitive response and pathogenicity,Hrp)基因广泛存在于植物病原细菌中,参与Hrp极毛系统的组装,不仅可运输效应蛋白至植物细胞,导致HR或抗病性,还可运输致病性和毒性蛋白或抑制子活性物质,引起植物病害。hrp基因多串联成簇且相当保守,在诱导培养基或植物体内,基因簇中的hrpA基因编码细菌表面附属物Hrp极毛的结构蛋白HrpA。Hrp极毛在植物-病原细菌互作中扮演十分重要的角色。病原细菌能否使亲和性植物发病与其是否有Hrp极毛有直接的关系。 在对hrp基因进行深入研究的基础上,我们尝试设计新的化学药剂和抗体阻止Hrp Ⅲ型分泌系统的组装或致病毒力蛋白因子的分泌运输,从而有效限制植物细菌病害的发展。本研究从特异性的以转化了丁香假单胞菌番茄变种菌株DC3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)hrpA基因的大肠杆菌(SGpQEHrpA/Ps)BL21(DE3)表达的工程蛋白HrpA/Ps为抗原制备而得的单克隆杂交瘤细胞系中提取RNA,经过RT-PCR获得抗体可变区基因,利用一柔性肽段(Linker)连接形成单链抗体(single chain variable fragment,scFv),后应用基因工程方法,将scFv与噬菌粒载体pCANTAB-5E连接,转化大肠杆菌TG1,获得单链抗体噬菌体文库。此后,利用噬菌体展示技术对抗体库进行了5轮淘选(panning),获得了HrpA特异性的单链抗体。 以单克隆抗体为来源的单链抗体,亲和力和特异性都较好,可以为进一步进行植物抗病基因工程和植物抗体研究提供基因来源。
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全文目录
摘要 7-8 英文摘要 8-9 1 前言 9-10 2 文献综述 10-21 2.1 植物病原细菌hrp基因 10-15 2.2 抗体工程 15-21 3 材料与方法 21-33 3.1 材料 21-24 3.1.1 细胞及细胞株 21-22 3.1.2 质粒载体 22 3.1.3 PCR引物 22-23 3.1.4 试剂与材料 23 3.1.5 仪器 23-24 3.2 实验方法 24-33 3.2.1 用于杂交瘤细胞性质鉴定及淘选用蛋白的制备 24-25 3.2.2 杂交瘤细胞的制备 25 3.2.3 单克隆抗体的型及亚类鉴定 25 3.2.4 单克隆抗体亲和常数的测定 25-26 3.2.5 杂交瘤细胞的制备及RNA提取 26-27 3.2.6 cDNA的合成 27 3.2.7 重、轻链可变区基因的PCR扩增 27-28 3.2.8 scFv片段的组装 28-29 3.2.9 pCANTAB 5E-scFv重组质粒的构建 29-30 3.2.10 电转感受态菌TG1的制备 30 3.2.11 scfv单链抗体噬菌体库的构建 30-31 3.2.12 单链噬菌体抗体库的富集筛选 31-32 3.2.13 scFv单链抗体融合表达和可溶性表达 32 3.2.14 ELISA检测HrpA特异性的单链抗体 32-33 4 结果与分析 33-40 4.1 淘洗用蛋白HrpA的制备 33 4.2 HrpA单克隆抗体类型及亚类的鉴定 33 4.3 HrpA单克隆抗体亲和力常数的测定 33-34 4.4 VH和VL的获得 34-35 4.5 Scfv DNA的组装和扩增 35 4.6 噬菌体抗体库的构建及噬菌体展示 35-37 4.7 Scfv特异性鉴定 37-38 4.7.1 ELISA检测鉴定 37 4.7.2 可溶性表达 37-38 4.8 scFv的PCR验证 38-39 4.9 测序 39-40 5 小结与讨论 40-43 5.1 杂交瘤细胞的复苏培养 40 5.2 杂交瘤细胞RNA的提取 40-41 5.3 噬菌体抗体库的构建 41 5.4 噬菌体表达载体 41 5.5 抗体库的淘选 41-42 5.6 测序 42 5.7 应用前景 42-43 参考文献 43-48 附录 48-55 致谢 55
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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵(传)染性病害
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