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抗伏马菌素B_1单链抗体的制备

作　者: 刘晓雷
导　师: 汪世华
学　校: 福建农林大学
专　业: 微生物学
关键词: 伏马菌素单链抗体噬菌体展示淘选
分类号: S182
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

伏马菌素是由串珠镰刀菌产生的一类能广泛污染粮食及其制品的真菌毒素,具有多种毒性,对人和动物健康产生严重威胁。本研究旨在为建立一种基于基因工程单链抗体的检测伏马菌素B1的方法提供前期基础,以便最终快速有效地检测粮食和饲料中FB1的含量。本研究以购买的伏马菌素B1纯品为基础,由于FB1是小分子半抗原,所以需要将其与大分子载体蛋白交联才能成为完全抗原。分别利用戊二醛一步法和二步法将伏马菌素B1与BSA和KLH两种载体蛋白偶联起来,制备得到FB1-BSA和FB1-KLH两种人工抗原,FB1-BSA作为免疫抗原,FB1-KLH作为检测抗原。抗血清效价测定结果证明这两种抗原均制备成功。用FB1-BSA免疫Balb/c小鼠,加强免疫后测定免疫小鼠抗血清效价,ELISA测定结果显示效价达到要求。处死并解剖小鼠后,取脾脏提取总RNA,反转录获得cDNA第一链,以其为模板进行PCR扩增得到抗体重链可变区和轻链可变区基因(VH, VL),然后进行组装和扩增得到单链抗体基因。将scFv基因克隆到噬菌体载体pCANTAB 5E上后,构建噬菌体抗体库,然后经过噬菌体表面展示技术进行淘选得到了一株可产生较高亲和力scFv的噬菌体单链抗体株,并进行了scFv的可溶性表达和鉴定。

全文目录

目录  5-7
摘要  7-8
Abstract  8-9
英文缩写词表  9-11
第一章文献综述  11-23
  引言  11
  1 伏马菌素及其污染现状  11-14
    1.1 伏马菌素生物学特性  11-13
    1.2 伏马菌素污染现状  13-14
  2 伏马菌素毒性及检测方法的研究  14-19
    2.1 伏马菌素的毒性  14-16
    2.2 伏马菌素的检测方法  16-18
    2.3 伏马菌素B_1人工抗原  18-19
  3 基因工程单链抗体技术  19-23
    3.1 单链抗体基因的构建  19-20
    3.2 单链抗体的表达  20
    3.3 噬菌体表面展示技术  20-23
第二章 FB_1人工抗原的制备  23-29
  引言  23
  材料与方法  23-26
    1 材料  23-24
    2 实验方法  24-26
  结果与分析  26-29
    1 结果  26-28
    2 讨论  28
    3 结论  28-29
第三章抗 FB_1单链抗体基因的克隆与抗体的淘选  29-53
  引言  29-30
  材料与方法  30-41
    1 材料  30-33
    2 实验方法  33-41
  结果与分析  41-50
    1 抗血清效价的测定  41-42
    2 脾脏总RNA 提取结果  42-43
    3 V_H 和V_L 基因的PCR 扩增  43
    4 ScFv 基因的组装与扩增  43-44
    5 噬菌体重组质粒载体的构建  44
    6 噬菌体抗体库的构建  44-45
    7 噬菌体抗体库富集淘选scFv  45-46
    8 单链抗体特异性鉴定  46-48
    10 ScFv 测序  48
    11 ScFv 的可溶性表达与ELISA 检测  48-50
  讨论  50-52
    1 小鼠免疫与血清效价测定  50
    2 总RNA 提取  50
    3 ScFv 的组装与扩增  50
    4 噬菌体抗体库的建立及单链抗体的富集淘选  50-52
  结论  52-53
参考文献  53-57
致谢  57-58
附录  58-65

抗伏马菌素B_1单链抗体的制备

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