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从噬菌体scFv人源抗体库中富集筛选抗Aβ抗体基因并初步鉴定

作　者: 刘喆
导　师: 梁平
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 病理和病理生理学
关键词: 阿尔茨海默病噬菌体展示技术单链可变区抗体
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Diseases AD）是一种多发在老年，以近期记忆和认知障碍为主要临床症状，以脑内认知和记忆相关区域出现老年斑（senile plaques SPs）和神经纤维缠结（neurofibrillary tangles NFT）为主要病理改变的退行性神经变性疾病。随着我国人口自上世纪末提前进入老龄化，AD已经继心脏病、肿瘤和脑卒中之后成为第四位的死亡原因。目前对该病的诊断和治疗没有理想的药物。有关AD的发病机制，目前普遍认为是β-淀粉样多肽（β-amyloid peptide Aβ）致病学说。近年来针对A β的免疫干预治疗成为研究AD的一个重要方向。利用噬菌体展示技术，筛选并鉴定抗A β多肽的人源单链可变区抗体（scFv）是本课题的主要目的。一方面，可以以筛选得到的抗A β多肽scFv抗体为基础，构建制备抗A β多肽的多种基因工程抗体，为AD被动免疫治疗方面的研究奠定良好的基础。另一方面，本课题用到的噬菌体展示技术实现了蛋白质表型和基因型的统一，使得该体系成为探索和分析蛋白质相互识别规律的一种极有价值的实验工具。本课题以Aβ多肽为抗原对噬菌体scFv人源抗体库进行筛选，从而得到抗Aβ多肽特异性噬菌体克隆。首先用Aβ多肽对抗体库进行4轮富集反应。用辅助噬菌体M13K07感染转化菌，以挽救出噬菌体形式的抗体库。将此抗体库加入用Aβ多肽包被的免疫管内，孵育一段时间后洗涤，能够与抗原特异结合的scFv噬菌体克隆将被保留在免疫管内壁，然后用pH 2.2的甘氨酸-HCl缓冲液将特异结合的噬菌体洗脱下来，经pH7.4的Tris-HCl中和后，感染处于对数生长期的E.coli TG 1，以扩增抗原特异性噬菌体克隆。重复上述操作3次。这样，经过4轮“吸附一洗脱一扩增”的富集过程，抗体库中与Aβ多肽特异性结合的噬菌体克隆从第一轮的5.1×10^-5增加到第五轮的1.38×10^-2，富集倍数共增加了271倍。phage-Elisa检测也显示了明确的富集效果。随机挑取75个克隆，用M13K07感染后使scFv展示于噬菌体颗粒表面，ELISA筛选呈现有抗Aβ多肽scFv的噬菌体克隆。检测结果表明，有5个克隆的OD₄₉₀值较高，P／N)2.1，对其中OD₄₉₀值最高的2个克隆（E6、F4）进行双酶切、PCR鉴定。经

全文目录

1 中文摘要  4-6
2 英文摘要  6-8
3 缩略词表  8-11
4 前言  11-15
5 实验材料  15-23
6 实验方法  23-38
  6.1 噬菌体scFv人源抗体库的初步鉴定  23-24
  6.2 从噬菌体scFv人源抗体库中富集筛选抗Aβ多肽的阳性克隆  24-27
  6.3 抗Aβ多肽阳性克隆的亲和筛选  27-29
  6.4 抗Aβ多肽阳性克隆鉴定  29-32
  6.5 阳性克隆株的可溶性表达及初步鉴定  32-38
7 实验结果  38-50
8 讨论  50-54
9 小结  54-55
10 参考文献  55-58
11 论文综述  58-69
12 致谢  69-70
13 个人简历  70

从噬菌体scFv人源抗体库中富集筛选抗Aβ抗体基因并初步鉴定

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