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抗白念珠菌天然单链抗体库的构建、筛选及初步鉴定

作　者: 路艳
导　师: 韩跃武
学　校: 兰州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 白念珠菌天然抗体库 ScFv 噬菌体展示重组基因筛选
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 9次
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内容摘要

目的:利用基因工程方法和噬菌体抗体库技术构建人源性白念珠菌单链抗体文库,并从中筛选出特异性的噬菌体单链抗体,为白念珠菌感染的免疫诊断及免疫治疗提供新的方法和手段。方法:1 ScFv的连接:取白念珠菌恢复期病人外周血淋巴细胞(PBMC)作为B细胞的来源,提取总RNA,反转录为cDNA,通过降落PCR的方法分别扩增抗体重链可变区(V_H)和抗体轻链可变区(V_L)基因片段。以V_H和V_L基因为模板分别扩增V_H-linker和V_L-linker,然后利用SOE-PCR将他们拼接成完整的单链抗体(ScFv)基因。最后,在单链抗体基因片段的两端引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。2 ScFv与噬菌粒载体pCANTAB-5E的拼接及抗体库的构建:单链抗体基因片段与噬菌粒载体pCANTAB-5E各自经SfiⅠ和NotⅠ酶切,连接成重组噬菌体,并转染感受态大肠杆菌XL1-Blue中表达,经辅助噬菌体(helper phage)VCSM13扩增后,构建出初级的噬菌体抗体库。3噬菌体抗体库的富集筛选:利用白念珠菌标准株与临床分离株对抗体库进行负正筛选,共进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,使抗体库得到有效富集。4噬菌体ScFv的ELISA鉴定:对第五轮筛选后的阳性克隆的亲和性分别用白念珠菌标准株、临床分离株和大肠杆菌进行ELISA鉴定。结果:1从人淋巴细胞中提取的总RNA在1.5%琼脂糖凝胶电泳结果中可见明显的28s、18s和5s条带;V_H基因片段的大小约为340bp,V_L基因片段的大小约为300bp;组装以后的ScFv基因片段约为700bp。2单链抗体基因片段和pCANTAB-5E分别经SfiⅠ和NotⅠ双酶切后,转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,结果获得4.5×10~7cfu/μg氨苄青霉素抗性克隆。随机酶切反应鉴定阳性插入率为83.3%(20/24)。质粒PCR与测序结果证实抗体重链和轻链以整码的单链抗体方式准确的插入载体。3经过5轮白念珠菌“吸附-洗脱-扩增”的负正性筛选,得到一个4.5×10~7的噬菌体抗体库,说明特异性的ScFv得到了有效富集。4对第五轮筛选后得到的噬菌体抗体进行ELISA检测,结果显示:3/9的克隆呈阳性反应。结论:利用噬菌体抗体库技术,构建了库容量为4.5×10~7的白念珠菌相关人源单链抗体库,并利用白念珠菌临床分离株进行初步筛选。通过ELISA鉴定,获得的噬菌体抗体克隆具有特异性,为白念珠菌感染的临床检测、药物治疗及耐药性的研究提供了理论依据。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-11
实验材料  11-18
实验方法  18-38
结果  38-44
讨论  44-51
结论  51-52
参考文献  52-57
攻读硕士期间发表的学术论文  57-58
致谢  58-59
缩略词表  59-60

抗白念珠菌天然单链抗体库的构建、筛选及初步鉴定

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