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CCR5膜外一、二环模拟肽的淘选及其对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的疗效研究

作　者: 郑慧敏
导　师: 郭葆玉
学　校: 第二军医大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: CC趋化因子受体5 模拟肽噬菌体展示肽库实验性自身免疫性脑脊髓炎
分类号: R744
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：本文研究的目的旨在获得与CC趋化因子受体5(CC chemokine receptor 5,CCR5)第一、二胞外环特异性结合的模拟肽,并将其应用到实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠模型,观察在应用模拟肽后对EAE模型小鼠的治疗效果。方法：首先,用噬菌体展示肽库筛选与CCR5第一、二胞外环特异性结合的模拟肽。随即挑取噬菌体克隆进行ELISA分析,将阳性克隆进行DNA测序分析,接着合成外源模拟肽,腹腔注射到EAE鼠。取小鼠脊髓组织,H＆E染色的方法来观察EAE组和CCR5模拟肽组小鼠脊髓组织的组织病理学改变。结果：1.用Ph.D.-7TM(噬菌体展示肽库试剂盒)亲和筛选了与CCR5特异结合的噬菌体,经过三轮筛选,噬菌体投入产出比逐渐升高,说明与CCR5亲和的噬菌体富集明显。2.采用ELISA方法测定从第三轮筛选出20个噬菌体克隆,结果表明有18个克隆均为阳性克隆,说明筛选使与CCR5特异性结合的噬菌体得到了有效富集。3.分别测定上述实验所得到的10个与CCR5特异性结合的阳性噬菌体克隆的氨基酸序列,结果显示：其中第一膜外襻中SLPLPKP、STFTTTL、QTSSAAL多肽序列分别占了6、6、5个,第二膜外襻中全部都是TPITQLL多肽序列。4.成功建立了EAE动物模型,并将上述四段小分子肽分别应用于EAE模型小鼠,结果显示：EAE组小鼠自免疫13天后开始发病,在第25天达到发病高峰,发病率为80%,临床评分的平均分为3分。而模拟肽组小鼠发病时间明显延迟,在第40天才达到发病高峰。5.脊髓组织病理切片经HE染色,显示EAE组小鼠脊髓的实质中有大量的炎症细胞浸润,以神经胶质细胞和星形胶质细胞为主,在白质区可见大小不等的髓鞘脱失区,而且髓鞘脱失区程度与EAE小鼠的临床症状的严重程度直接相关。而给予CCR5模拟肽组小鼠脊髓的实质中仅有少量的炎症细胞浸润,且没有髓鞘脱失。结论：用CCR5模拟肽治疗EAE鼠后,和对照组相比有效的改善了疾病的发病进程并且对EAE提供了有意义的保护作用。更进一步的组织病理学分析显示在CCR5模拟肽治疗组小鼠脊髓组织的单核细胞和淋巴细胞浸润明显减少。而在未经CCR5模拟肽治疗组的EAE鼠脊髓组织中有大量的炎症细胞浸润,并且在白质脱髓鞘明显。本研究实验结果表明,4段短肽分别具有抑制、延迟发生EAE的作用。其平均抑制率为43%,效果显著(P<0.05)。以此可以说明与CCR5竞争结合的模拟肽在EAE的发病过程中具有非常重要的作用。也为我们间接的提供了一条治疗MS的可以借鉴的新方法。提示：CCR5模拟肽可能在EAE的治疗和对临床人类多发性硬化(multiple scleroses, MS)的治疗中是一个候选药物。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-14
实验材料  14-20
  一、实验动物  14
  二、筛选CCRS模拟肽所需试剂  14
  三、主要的化学药品和生物试剂  14-15
  四、主要试剂的配制  15-19
  五、主要仪器与设备  19-20
实验方法  20-26
  一、用Ph.D.-7~(TM)噬菌体展示肽库试剂盒，筛选与CCR5特异结合的噬菌体  20-23
  二、EAE的诱导及神经功能评分  23-24
  三、常规HE染色检查病理学改变  24-26
实验结果  26-35
  一、亲和筛选与CCR5特异结合的噬菌体  26
  二、结合噬菌体的ELISA鉴定  26-28
  三、结合克隆的序列分析  28-29
  四、阳性噬菌体克隆的竞争抑制实验结果  29
  五、EAE组小鼠及CCR5模拟肽组小鼠的发病情况  29-32
  六、病理学检查  32-34
  七、四种短肽对EAE组小鼠和CCR5模拟肽对照组小鼠发病率的影响  34-35
讨论  35-42
参考文献  42-45
参编专著  45-70
在读期间发表论文发表情况  70-71
在学期间参加的会议  71-72
致谢  72-73
附录  73-75

CCR5膜外一、二环模拟肽的淘选及其对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的疗效研究

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