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新抗体Met4用于免疫组化评价乳腺癌Met表达水平的研究人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析

作　者: 熊林
导　师: 曹伯良
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理与病理生理
关键词: 乳腺癌 Met 单克隆抗体免疫组化基因工程抗体融合蛋白 Fc片段
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

乳腺癌是世界范围内女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁着广大女性的生命健康。随着对肿瘤发生、发展分子机制的深入研究,Met作为一个重要的肿瘤分子标志物日益受到人们的关注。癌基因编码的膜蛋白Met是肝细胞生长因子(HGF/SF)已知的唯一受体,属于具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体类。在正常组织中Met有少量表达,而在多种实体肿瘤中存在不同程度的高表达,Met在乳腺癌中过表达并且和乳腺癌浸润转移及预后有密切联系。Met表达的准确评价将有利于乳腺癌患者进行分子靶向治疗。目前国内外研究中常用的Met抗体是兔抗人Met多克隆抗体(C28)。由于多克隆抗体难以实行标准化和质量控制且存在非特异性染色问题,本课题组研制出一种新的鼠单克隆抗体Met4,专门用于免疫组化检测福尔马林固定石蜡包埋标本中的Met检测。目的:1)用Met4检测临床乳腺癌石蜡包埋切片中Met的表达。2)比较Met4和C28的检测效能。方法:1)收集2001-2006年的女性乳腺浸润性导管癌70例,用Met4作为一抗进行免疫组化检测,分析Met表达与患者年龄、肿瘤大小、转移、组织学分级等乳腺癌临床病理特征的联系。2)用Met4检测17例患者的转移淋巴结和癌旁组织中Met的表达情况并与对应的原发肿瘤比较。3)挑选21例Met4检测为中等阳性或强阳性的病例以C28作为一抗评价Met水平,比较Met4和C28的检测效能。结果:1、Met4染色的乳腺癌组织中Met阳性表达均位于肿瘤细胞膜或细胞浆, 11例(阳性率16%)浆表达阳性,19例(阳性率27%)。2、Met的表达与年龄、组织学分级、淋巴转移均无显著相关。但膜染色与肿瘤大小出现正相关趋势。3、乳腺癌原发肿瘤与转移淋巴结均表达Met,表达类型无明显差异,在癌旁组织仅见Met弱表达或不表达。4、Met4染色主要位于肿瘤细胞浆或细胞膜,无细胞核染色;C28染色主要位于肿瘤细胞浆,无细胞膜染色,在细胞核有较多非特异性染色。Met4组与C28组检测结果细胞浆染色无显著性差别,细胞核非特异性染色差异性明显。结论:1、Met在乳腺癌中过表达。2、Met4可以作为乳腺癌的免疫组化诊断试剂。目的将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgG Fc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性。方法从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc。所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价。结果序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60Ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合。结论改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备。

全文目录

第一部分、新抗体Met4 用于免疫组化评价乳腺癌Met 表达水平的研究  3-28
  摘要  3-5
  Abstract  5-7
  前言  7-11
  材料与方法  11-15
  结果  15-21
  讨论  21-24
  小结  24-25
  参考文献  25-28
第二部分、人源抗Met 基因工程抗体scFv 的改造与特性分析  28-55
  摘要  28-29
  Abstract  29-30
  前言  30-31
  材料与方法  31-45
  结果  45-49
  讨论  49-54
  小结  54-55
附录：文献综述  55-63
  参考文献  59-63
攻读学位期间发表文章情况  63-64
致谢  64-65

新抗体Met4用于免疫组化评价乳腺癌Met表达水平的研究人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析

内容摘要

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