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抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体的构建、表达及生物学活性检测

作　者: 于蕊
导　师: 陈昭烈
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: CD20 CD3 双特异性单链抗体表达生物学活性
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

BiTEs（bispecific T cell engagers）是以T细胞作为效应细胞的双特异性单链抗体,它采用单链抗体技术,将两个不同抗体的重链及轻链可变区连接在一条多肽链上,并作为活性蛋白在CHO细胞中进行分泌表达,其基本的形式是V_L1-linker-V_H1-linker-V_H2-linker-V_L2。BiTEs具有两个抗原结合部位,可以同时和T细胞及病变细胞表面的抗原分子结合,从而有效地激活静止的T细胞来达到杀伤病变细胞的目的。抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体是一种BiTEs形式的极具潜力的新型工程抗体,它以CD20为靶标,具有靶向杀伤B细胞淋巴瘤的功能。本实验通过重叠延伸PCR扩增获得抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体完整基因片段:前导序列—VL_CD3—（G₄S）₃—VH_CD3—（G₄S）₃—VH_CD20—（G₄S）₃—VL_CD20—（His）₆—。将上述片段连入瞬时表达载体pcDNA3.1及真核定点表达载体pcDNA5/FRT中,分别获得了瞬时表达及稳定表达质粒。目的基因在FlP—In^TM CHO细胞中获得稳定表达,其表达量约为300μg/L培养上清。采用用Ni-NTA纯化系统进行对培养上清进行亲和层析,得到了纯度较高、分子量为59.5KD的目的蛋白。活细胞间接免疫荧光法结果显示此抗体可以与表达CD3抗原的Jurkat细胞以及表达CD20抗原的Ramous细胞发生特异性结合,玫瑰花环实验显示该抗体在体外可诱导效应细胞聚集在靶细胞周围。扫描电镜观察和非放射性细胞杀伤检测实验证明抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体可有效介导IL-2预激活的人外周血淋巴细胞杀伤B淋巴瘤细胞Ramous。在抗体浓度为5μg/ml,反应时间24h时,裂解活性随效靶比的升高而增加,在效靶比为10:1时杀伤活性最高可达87.3%;固定效靶比10:1时,杀伤活性随抗体浓度的升高和反应时间的增加而升高。AV/PI染色表明抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体可能介导T细胞主要以诱导细胞凋亡的方式来起到杀伤靶细胞的作用。采用基因芯片技术检测加药前后Ramous细胞凋亡相关基因的表达变化,推测该抗体介导的T细胞诱导靶细胞主要以ATM-p53途径发生凋亡。以上结果表明抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体具有开发成为一种针对表达CD20抗原的B细胞淋巴瘤的新型治疗性抗体的潜力。

抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体的构建、表达及生物学活性检测

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