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具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的人源含硒单链抗体酶的改造

作　者: 孙卫国
导　师: 魏景艳
学　校: 吉林大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 谷胱甘肽过氧化物酶单链抗体结构分析定点突变含硒酶
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是抗氧化酶系的重要成员,它通过催化谷胱甘肽（GSH）还原氢过氧化物,能有效地清除生物体内的自由基,从而保护细胞免受氧化损伤,对防治由活性氧引起的多种疾病具有潜在药用价值。但是天然GPX稳定性差、来源有限、分离纯化困难等不利因素限制了此酶的开发和应用,人们开始转向该酶人工模拟物的研究。对已有的GPX模拟酶深入研究表明,产生底物结合位点是制备高活力GPX模拟酶的关键因素之一。单克隆抗体（McAb）制备技术是产生具有底物结合部位受体的有效手段,为酶的人工模拟开辟了新途径。但最初通过杂交瘤技术获得的McAb相对分子量较大,且为鼠源性,限制了抗体酶的应用。相比之下,单链抗体（scFv）则更适合用作药物,通过一个连接肽（linker）将抗体的重链可变区（V_H）和轻链可变区（V_L）连成一条链构成的单链抗体,较好地保持了抗原亲和性,大大降低了免疫原性,穿透组织能力加强,可经大肠杆菌高效表达,因而更适合于用作药物。通过原核表达我们已成功制备出了人源单链抗体scFv-B3,但其对应的含硒催化抗体Se-scFv-B3的活力与天然GPX还有差距。我们与吉林大学理论化学计算国家重点实验室郑清川老师课题组合作对scFv-B3进行了结构分析,对预测的活性位点进行了人工改造,将scFv-B3的44位的丙氨酸（Ala44）和180位的丙氨酸（Ala180）分别突变成丝氨酸（Ser）。这两种突变体和未突变的人源单链抗体scFv-B3都经大肠杆菌Rosetta实现了可溶性表达,再经Ni²⁺螯合亲和层析（IMAC）纯化。然后,通过化学法将丝氨酸残基修饰为硒代半胱氨酸（Sec）,从而实现了单链抗体的硒化。突变含硒单链抗体的GPX活力有较大提高,突变型Se-scFv-B3-A180S的活力约为Se-ScFv-B3的2倍。这一研究结果为酶的人工改造提供了一个新的思路,也为本领域今后的深入研究奠定了基础。

全文目录

内容提要  4-8
第1章绪论  8-19
  1.1 谷胱甘肽过氧化物酶及人工模拟  8-13
  1.2 目的蛋白的制备  13-15
  1.3 蛋白质的结构分析  15-16
  1.4 酶的定点突变改造  16-18
  1.5 立题意义与研究策略  18-19
第2章人源单链抗体的结构分析  19-24
  2.1 理论方法  19
  2.2 结果  19-23
  2.3 讨论  23-24
第3章突变单链抗体的表达和纯化  24-39
  3.1 仪器与材料  24-27
  3.2 方法  27-33
  3.3 结果  33-37
  3.4 讨论  37-39
第4章突变单链抗体的硒化和活力测定  39-44
  4.1 仪器与材料  39-40
  4.2 方法  40-42
  4.3 结果  42
  4.4 讨论  42-44
研究结论  44-45
参考文献  45-52
中文摘要  52-55
Abstract  55-58
致谢  58

具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的人源含硒单链抗体酶的改造

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