学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

人内皮抑素（hES）的亚克隆、表达、抗体制备及其生物学活性的初步研究

作　者: 柯细松
导　师: 曾昭淳
学　校: 重庆医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: endostatin 融合表达蛋白质复性多克隆抗体抗血管生成
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
下　载: 66次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。肿瘤的生长、转移依赖于血管生成。通过抑制肿瘤相关的血管生成可以抑制肿瘤的生长。1997年，Folkman和O’Reilly发现了一种内源性的血管及肿瘤生长抑制剂--内皮抑素(endostatin)，endostatin是胶原XVIII的C-端184个氨基酸片段，其中酸性氨基酸16个，碱性氨基酸29个，半胱氨酸4个，疏水氨基酸占42%， pI为9.3。它是天然而有效的血管生成抑制剂，是专一的内皮细胞增殖抑制物，能抑制来源于不同组织的肿瘤形成和迁移而不引起抗药性。本课题运用基因工程技术，将从人胎肝组织克隆的内皮抑素（human endostatin, hES）基因进行原核表达、纯化，检测重组hES的抑制内皮细胞增殖及抗血管生成的生物学活性，并制备高效价的特异的抗hES多克隆抗体（pAb）。我们采用亚克隆技术从重组克隆载体pT-hES获得hES基因，构建融合表达载体pGEX-hES，重组质粒导入大肠杆菌E .coli BL21，IPTG诱导表达；用初步纯化的hES包涵体蛋白免疫新西兰大白兔，制备抗<WP=7>hES多克隆抗体（兔抗人），Western-blotting检测其在小鼠肝、肾等组织的表达，鉴定抗体对体内endostatin的特异性；通过浓度梯度及pH梯度透析对GST-hES包涵体蛋白进行蛋白质复性，用Glutahione Sepharose 4B 亲和纯化融合蛋白, 凝血酶酶切得到hES，用内皮细胞（ECV304）增殖抑制实验及鸡胚绒毛膜尿囊膜（CAM）实验分别检测hES在体内及体外的抗血管生成活性。大肠杆菌表达的融合蛋白GST-hES为不溶性的包涵体。融合蛋白GST-hES在E .coli BL21中的菌体总蛋白含量为48.5%，蛋白质复性后得到可溶性的融合蛋白，经纯化后纯度达90.5%（薄层扫描分析）。用凝血酶酶切融合蛋白后，得到分子量约为20kDa的hES。生物学活性试验表明hES可显著抑制体外培养的的内皮细胞增殖（P<0.05），浓度大于100μg/ml时明显使细胞数减少；3μg的hES可使由VEGF刺激的鸡胚CAM新生血管化率下降30%，表明重组hES具有抑制内皮细胞增殖及新血管生成的活性。制备的抗hES多克隆抗体检测出endostatin在小鼠肝、肾等组织的表达差异，表明其对体内 endostatin具有特异识别与结合的能力。我们研究结果表明hES对内皮细胞增殖及新血管生成具有明显抑制作用，提示其在肿瘤及新生血管性疾病的治疗中有潜在的应用前景。hES的成功表达及抗hES抗体制备为抗血管生成治疗实体瘤的研究及相关疾病的检测奠定了实验基础。<WP=8>

全文目录

符号说明  3-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
第一部分 hES基因的亚克隆  15-24
  材料与方法  15-18
  结果  18-22
  讨论  22-24
第二部分 hES在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其复性  24-38
  材料与方法  24-29
  结果  29-33
  讨论  33-38
第三部分抗hES抗体的制备及免疫印迹（immunoblotting）  38-45
  材料与方法  38-42
  结果  42-43
  讨论  43-45
第四部分 hES生物学活性的初步研究  45-50
  材料与方法  45-47
  结果  47-48
  讨论  48-50
全文结论  50-51
参考文献  51-55
致谢  55-56
研究生在读期间发表及待发表的论文  56

人内皮抑素（hES）的亚克隆、表达、抗体制备及其生物学活性的初步研究

内容摘要

全文目录

相似论文