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斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究

作　者: 王树云
导　师: 陈孝煊；李莉娟
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 斑点叉尾鮰病毒 ORF6 ORF10 原核表达 多克隆抗体
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 23次
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内容摘要


斑点叉尾鮰病毒(CCV)是最早被发现的鱼类疱疹病毒,由Fijan等从驯养的斑点叉尾鮰病鱼体内分离得到,斑点叉尾鮰是其自然宿主。CCV是一种被膜的双链DNA病毒,给国内外的斑点叉尾鮰养殖业造成极其严重的经济损失。序列分析显示斑点叉尾鮰开放阅读框ORF6和ORF10为预测的膜蛋白基因,可能参与病毒的吸附、入侵以及传播过程,因此,本文选择ORF6和ORF10两个基因进行研究,主要取得以下结果：1、将斑点叉尾鮰卵巢细胞CCO复苏,在28℃下,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基传代培养,并以CCO来增殖斑点叉尾鮰病毒CCV,通过酚氯仿法从细胞培养液中提取CCV全基因组DNA。2、根据CCV基因序列,设计并合成ORF6和ORF10的特异性引物,通过PCR扩增获得ORF6和ORF10全基因序列,大小分别为417 bp和456 bp；克隆至表达载体pET-32a,构建原核表达载体pET-32a-ORF6和pET-32a-ORF10;经IPTG诱导,ORF6和ORF10基因成功表达,目的条带显示的分子量大小和理论值35.4 KD和36.4KD稍有差异,目的蛋白均以包涵体形式存在。3、纯化表达产物后免疫新西兰大白兔,制备ORF6和ORF10的多克隆抗体,Western Blot检测结果表明获得的ORF6和ORF10多克隆抗体特异性较好,且ORF10是CCV病毒粒子的结构蛋白。ORF6和ORF10多克隆抗体的中和实验表明两个多克隆抗体可以有效抑制CCV对CCO的感染,具有一定的保护作用；对于不同时相下的同一多克隆抗体浓度实验组而言,随着感染时间的加长,CCO细胞病变越来越严重,两个多克隆抗体的保护性越来越弱；对比同一时相同一浓度,ORF10多克隆抗体比ORF6多克隆抗体抑制细胞病变的能力强,推断ORF10多克隆抗体具有更好的保护性。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
缩略词表  9-10
第一章 文献综述  10-20
  1 斑点叉尾蛔病毒病  10-13
    1.1 斑点叉尾徊生物学特性  10
    1.2 斑点叉尾如病毒病流行病学特征  10-13
  2 斑点叉尾蛔病毒  13-15
    2.1 斑点叉尾胭病毒的分类地位和理化性质  13
    2.2 斑点叉尾胭病毒的分子生物学特性  13-15
      2.2.1 CCV的生长、繁殖  13-14
      2.2.2 CCV基因组及其所编码蛋白的研究  14-15
  3 抗斑点叉尾蛔病毒病疫苗的研究进程  15-17
  4 其它疙疹病毒科成员的基因及蛋白功能的研究  17-18
  5 本研究的目的和意义  18-20
第二章 CCO的培养和CCV的增殖  20-26
  1 材料和方法  20-22
    1.1 实验材料  20-21
      1.1.1 细胞、病毒  20
      1.1.2 实验的主要试剂及其来源  20-21
      1.1.3 实验器材及其产地  21
    1.2 实验方法  21-22
      1.2.1 CCO复苏和传代培养  21
      1.2.2 CCV的增殖  21-22
      1.2.3 CCV基因组序列的抽提  22
  2 结果与分析  22-25
    2.1 CCO的培养  22
    2.2 CCV的增殖  22-25
  3 讨论  25-26
第三章 ORF6和ORF10基因的克隆及表达  26-38
  1 材料和方法  26-31
    1.1 实验材料  26-28
      1.1.1 病毒、菌株和载体  26
      1.1.2 原核载体构建主要试剂及来源  26-27
      1.1.3 蛋白表达和鉴定的主要试剂及来源  27
      1.1.4 实验所用仪器设备及产地  27-28
    1.2 实验方法  28-31
      1.2.1 特异性引物的设计与基因的PCR扩增  28
      1.2.2 原核表达载体的构建  28-31
      1.2.3 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达  31
      1.2.4 表达蛋白的Western Blot检测  31
  2 结果与分析  31-36
    2.1 ORF6/ORF10的PCR扩增及重组表达载体的酶切鉴定  31-33
    2.2 ORF6和ORF10在大肠杆菌中的诱导表达  33-36
      2.2.1 目的基因的诱导表达  33
      2.2.2 表达产物的可溶性分析  33-36
  3 讨论  36-38
第四章 ORF6和ORF10的抗体的制备及其保护性研究  38-46
  1 材料和方法  38-40
    1.1 实验材料  38-39
      1.1.1 细胞、病毒  38
      1.1.2 实验试剂和耗材  38-39
    1.2 实验方法  39-40
      1.2.1 表达蛋白的纯化  39
      1.2.2 多克隆抗体的制备  39-40
      1.2.3 ORF6和ORF10多克隆抗体的保护性实验  40
  2 结果与分析  40-41
    2.1 多克隆抗体的特异性检测  40-41
    2.2 ORF6和ORF10多克隆抗体的保护性研究  41
  3 讨论  41-46
参考文献  46-53
致谢  53-54
附表Ⅰ:实验中试剂的配制方法  54-58
附表Ⅱ:硕士期间发表的论文  58

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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