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三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)高血糖激素基因的克隆与分析

作　者: 杨济芬
导　师: 朱冬发
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 三疣梭子蟹 高血糖激素 cDNA克隆 原核表达 多克隆抗体
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


甲壳动物眼柄的X-器窦腺复合体(X-organ -sinus gland,XO-SG)是神经内分泌的主要调控中心,合成与分泌高血糖激素家族神经肽(crustacean hyperglycemic hormone family,CHH家族),包括高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)、蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone ,MIH)、性腺抑制激素(gonad-inhibiting hormone,GIH)和大颚器抑制激素(mandibular organ-inhibiting hormone,MOIH),协同调控着甲壳动物的生长、繁殖与蜕皮等生理生化过程。比对CHH / MIH / GIH / MOIH序列结构发现,只有在CHH的cDNA序列中发现在信号肽与成熟肽之间存在着一段CHH前体相关肽(CHH precursor-related peptide ,CPRP),而MIH / GIH / MOIH的cDNA序列中信号肽则直接与成熟肽相连。因此,根据基因结构可以将CHH家族神经肽分为CHH与MIH / GIH / MOIH两个亚族,或者称CHHⅠ族与CHHⅡ族。本文通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)眼柄CHH (Pot-CHH)全长cDNA序列,全长1952bp,GenBank登录号:EU395808。序列分析发现,Pot-CHH序列含86bp的5’端非编码区, 417bp的编码区和1449bp的3’端非编码区。编码区用Signal 3.0 Server预测,得到了由27个氨基酸残基组成的信号肽序列,35个氨基酸残基组成的CHH前体相关肽(CPRP)序列,76个氨基酸残基组成的CHH成熟肽。CPRP与成熟肽的割裂位置为保守的KR位点,3’端非编码区包含一个保守的加尾信号(AGTAAA),距离下游的Poly(A)51bp。序列比对结果表明,Pot-CHH与日本蟳(Charybdis japonica )和榄绿青蟹(Scylla olivacea)的CHH同源性最高,达到80%,与其他甲壳动物CHH的同源性均超过60%。组织表达研究表明,Pot-CHH在XO-SG、胸神经节、腹神经节、Y器、和肠中表达,而在视网膜、心、精巢、卵巢、肌肉、脑、腮和肝胰腺等组织不表达。这一结果表明,Pot-CHH具有组织表达特异性,这可能与CHH多种生理功能相关。采用pET-28a载体构建Pot-CHH重组蛋白表达载体(pET-CHH与His-pET-CHH),转化表达菌株大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导之后,成功获得两种重组CHH蛋白:Pot-CHH重组蛋白和带His标签的His-Pot-CHH重组蛋白。并且利用纯化的Pot-CHH重组蛋白注射ICR小鼠制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体不仅能与Pot-CHH重组蛋白特异性的结合,而且能与His-Pot-CHH重组蛋白结合。CHH重组蛋白与多克隆抗体的制备为今后更准确的研究CHH的多种生理功能打下基础。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
第一章 绪论：甲壳动物高血糖激素家族生理功能研究进展  13-21
  1 研究方法  13-15
    1.1 眼柄切除术  13-14
    1.2 活体注射法  14
    1.3 原核表达技术  14-15
    1.4 免疫组化法  15
    1.5 RNAi 技术  15
  2 生理功能  15-18
    2.1 蜕皮调控  15-16
    2.2 形态发生调控  16-17
    2.3 性腺发育调控  17
    2.4 血糖水平调控  17-18
  3 CHH 家族神经肽分泌调控  18-20
    3.1 自身调控  18
    3.2 外界因子调控  18-20
      3.2.1 环境条件调控  18-19
      3.2.2 神经递质调控  19-20
  4 展望  20-21
第二章 三疣梭子蟹高血糖激素cDNA 的克隆与组织表达  21-34
  1 材料和方法  21-24
    1.1 材料  21
    1.2 试剂和引物  21
    1.3 主要仪器  21-22
    1.4 总RNA 的提取与反转录  22
      1.4.1 总RNA 的提取方法  22
      1.4.2 反转录操作方法  22
    1.5 RT-PCR  22-23
    1.6 3′-RACE  23
    1.7 5′-RACE  23-24
    1.8 三疣梭子蟹CHH 基因组织表达  24
    1.9 产物克隆与测序  24
    1.10 序列分析  24
  2 结果  24-31
    2.1 三疣梭子蟹CHH 基因的克隆  24-25
    2.2 序列比对分析及系统进化树  25-26
    2.3 三疣梭子蟹CHH 基因组织表达  26-31
  3 讨论  31-34
第三章 三疣梭子蟹CHH 基因的原核表达及多克隆抗体制备  34-46
  1 材料与方法  34-38
    1.1 材料  34-35
      1.1.1 原核表达材料  34
      1.1.2 Western blot 材料  34-35
    1.2 方法  35-38
      1.2.1 表达载体的构建  35
      1.2.2 原核表达Pot-CHH 蛋白  35-36
      1.2.3 SDS-PAGE 电泳  36-37
      1.2.4 原核表达带有His 标记的Pot-CHH 蛋白  37
      1.2.5 多克隆抗体制备  37
      1.2.6 Western blot  37-38
  2 结果  38-43
    2.1 表达载体的构建  38
    2.2 原核表达Pot-CHH 蛋白  38-42
    2.3 Pot-MIH 重组蛋白的纯化  42
    2.4 多克隆抗体制备及western blot  42-43
  3 讨论  43-46
结论  46-47
参考文献  47-54
在学期间成果  54-55
致谢  55

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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