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鸡RANKL活性区基因的克隆、表达及抗体制备

作　者: 于杨
导　师: 侯加法
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: ISA蛋鸡 RANKL 表达 多克隆抗体 骨质疏松
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 6次
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内容摘要


核因子-KB受体激活物配基RANKL (receptor activator of NF-KB lignad, RANKL)最早发现于哺乳动物,属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的一员,它参与破骨细胞形成的全过程：分化、融合、生存、激活,被认为是介导各种刺激因子诱导破骨细胞生成及功能信号传导的最终因子。鉴于RANKL在骨代谢中的重要调节作用,本文旨在克隆表达蛋鸡RANKL活性区蛋白,并制备多克隆抗体,为更深入研究笼养蛋鸡骨质疏松奠定基础,提供RANKL特异性抗体。本试验应用PCR方法扩增得到鸡RANKL编码基因(Genbank登录号EF379383),将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定及DNA序列测定。结果表明,扩增得到651 bp的RANKL活性区序列,扩增序列与Genbank上报道的预测序列完全一致。将鸡RANKL活性区成熟蛋白编码基因克隆入原核表达载体pET-28a(+)。重组表达载体pET-28a(+)-chRANKL转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析,原核表达产物为27KD的重组蛋白,与预期结果一致。该诱导表达产物主要以包涵体形式存在。用抗His标签单克隆抗体为一抗,经western blotting分析结果显示,表达得到的重组蛋白能与抗His标签单克隆抗体结合,具有良好的抗原结合活性,证明该表达蛋白是RANKL活性区成熟蛋白,表达获得成功。表达蛋白经Ni亲和柱纯化,经SDS-PAGE凝胶电泳分析无其它杂带,可用做免疫抗原。纯化后的融合蛋白,通过四次免疫程序,免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到多克隆抗体效价达到1：106。蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清可特异性结合。试验证实,该抗体可应用于细胞免疫组化和组织蛋白Western blot鉴定。

全文目录


摘要  9-10ABSTRACT  10-12前言  12-13上篇 文献综述  13-25  第一章 RANKL的研究进展  13-22    1 RANKL的发现  13    2 RANKL的结构和分布  13-14    3 RANKL的功能  14-15      3.1 RANKL对骨代谢的作用  14-15        3.1.1 RANKL是破骨细胞的分化因子  14        3.1.2 RANKL对钙代谢的影响  14        3.1.3 反义RANKL基因对OC生成的影响  14-15      3.2 RANKL对免疫系统的作用  15    4 RANKL的作用机制  15    5 RANKL的信号转导通路  15-16      5.1 c-Src途径  15-16      5.2 JNK途径  16      5.3 NF-κB途径  16    6 RANKL与骨免疫学  16-17    7 RANKL与一些骨疾病的关系  17-20      7.1 RANKL与骨质疏松  17      7.2 RANKL与骨折和类风湿性关节炎(RA)  17-18      7.3 RANKL与人工关节无菌性松动  18-19      7.4 RANKL与牙周炎  19-20    8 RANKL与蛋鸡骨质疏松症  20-22  参考文献  22-25下篇 试验研究  25-61  第二章 鸡RANKL活性区基因的克隆  25-35    1 材料与方法  25-29      1.1 材料  25-26        1.1.1 菌体和载体  26        1.1.2 主要仪器  26        1.1.3 主要试剂  26      1.2 方法  26-29        1.2.1 引物设计  26        1.2.2 聚合酶链反应(PCR)  26-27        1.2.3 PCR产物的克隆  27-28        1.2.4 重组载体pMD18-T-RANKL的鉴定和PCR产物序列测定  28-29    2 结果  29-31      2.1 鸡RANKL基因的序列分析  29      2.2 鸡RANKL cDNA的扩增  29-30      2.3 重组质粒pMD18-T-chRANKL的构建及酶切鉴定结果  30      2.4 重组质粒pMD18-T-chRANKL的序列比较  30-31    3 讨论  31-32    4 小结  32-33    参考文献  33-35  第三章 鸡RANKL活性区基因的原核表达、纯化及鉴定  35-51    1 材料与方法  35-42      1.1 材料  35-36        1.1.1 菌体和载体  36        1.1.2 主要仪器  36        1.1.3 主要试剂  36      1.2 方法  36-42        1.2.1 鸡RANKL原核表达载体的构建  36-37        1.2.2 原核表达载体pET-28a(+)-chRANKL的鉴定  37        1.2.3 菌株的诱导表达  37-38        1.2.4 菌株的优化诱导表达  38        1.2.5 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定表达产物  38-39        1.2.6 表达产物存在形式的确定  39-40        1.2.7 包涵体的制备溶解  40        1.2.8 表达产物的纯化  40        1.2.9 Western blot鉴定表达产物  40-42    2 结果  42-47      2.1 原核表达质粒的构建及鉴定  42-43      2.2 鸡RANKL的诱导表达鉴定  43-45      2.3 鸡骨钙素诱导表达蛋白形式的鉴定  45      2.4 表达产物的纯化  45-46      2.5 样品蛋白浓度的测定  46      2.6 鸡RANKL蛋白Western blot分析  46-47    3 讨论  47-48    4 小结  48-49    参考文献  49-51  第四章 抗鸡RANKL多克隆抗体的制备和应用  51-61    1 材料与方法  51-55      1.1 主要试剂  51-52      1.2 主要仪器  52      1.3 方法  52-55        1.3.1 鸡RANKL多克隆抗体的制备  52        1.3.2 间接ELISA检测抗体效价  52-53        1.3.3 鸡RANKL蛋白抗体的Western blot鉴定  53        1.3.4 鸡RANKL蛋白抗体的免疫细胞化学应用  53-55        1.3.5 鸡RANKL蛋白抗体的Western blot应用  55    2 结果  55-57      2.1 兔抗RANKL 血清效价的测定  55      2.2 兔抗RANKL 血清效价的Western blot鉴定  55-56      2.3 成骨细胞培养及鉴定  56      2.4 兔抗RANKL 血清的免疫细胞化学应用  56-57      2.5 兔抗RANKL 血清的Western blot应用  57    3 讨论  57-58    4 小结  58-59    参考文献  59-61全文总结  61-63论文创新之处  63-65致谢  65

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
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