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口蹄疫A型病毒AF/72株主要B细胞表位的筛选鉴定

作　者: 陈启伟
导　师: 王永录；杨孝朴
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: FMDV B细胞表位同源建模表位预测基因克隆原核表达多克隆抗体间接酶联免疫吸附试验
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 47次
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内容摘要

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、烈性、高度接触性传染病。口蹄疫病毒(FMDV)是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、口疮病毒属(Aphthovirus)的代表性成员,有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1型等7个血清型。FMDV上的B细胞表位,是病毒抗原分子的免疫活性区,可以被B细胞受体(B cell receptor,BCR)识别激活进而刺激机体产生特异性抗体。本试验从FMD A型病毒AF/72株的BHK-21细胞培养物中提取总mRNA,根据GenBank中已经发表的其他FMD A型病毒基因序列,设计PCR扩增引物,利用RT-PCR技术扩增P1、2ABC后,将其产物与pGEM-T easy载体连接,构建重组克隆载体pGEM-T-P1、pGEM-T-2ABC并进行序列测定。基因测序结果表明,本试验所获得的P1、2ABC基因核苷酸序列和所编码氨基酸序列与GenBank中收录的其他A型FMDV蛋白P1、2ABC基因同源性较高,分别达到92%和94%以上。在对P1、2ABC蛋白进行同源建模的基础之上,运用多种抗原表位分析方法,对VP2、VP3、2C上潜在的B细胞表位进行预测,并人工合成相应的表位肽段。根据基因测序结果,分别重新设计并合成原核表达引物,并以重组质粒pGEM-T-P1、pGEM-T-2ABC为模板,进行PCR扩增,获得VP2、VP3、2C基因片段。原核表达载体pET-28a(+)和目的基因VP2、VP3、2C扩增产物分别经相应酶切后连接,构建重组原核表达载体pET-VP2和pET-VP3、pET-2C,并将其分别转化到BL21(DE3)宿主菌中,用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析表明,基因片段VP2、VP3、2C在大肠杆菌中成功获得了表达,结构蛋白VP2分子量大小为25KDa左右,结构蛋白VP3分子量大小为24KDa左右,非结构蛋白2C分子量为36KDa左右,与预期的大小吻合,并且所表达的目的蛋白大部分以包涵体形式存在。将包涵体纯化后,与弗氏佐剂乳化配制疫苗,免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,经间接ELISA和Western Blot分析表明兔抗VP2、VP3、2C多克隆抗体的效价都达到了1:16000以上,且具有较高的特异性。以人工合成的抗原表位肽段作为抗原,制备的多克隆抗体作为一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为二抗,参照常规间接ELISA方法对潜在表位进行筛选鉴定。结果显示,结构蛋白VP2上的1aa-12aa和165aa-183aa肽段具有较好的反应原性,结构蛋白VP3上的30aa-46aa、128aa-142aa和206aa-221aa肽段具有较好的反应原性,而非结构蛋白2C的优势B细胞表位存在于1aa-16aa和41aa-56aa。综上所述,A型FMDV主要B细胞表位的筛选鉴定为进一步研发FMD A型多表位疫苗提供了重要技术参数。

全文目录

摘要  4-5
Summary  5-7
英文缩略表  7-10
第一章序言  10-12
第二章文献综述  12-25
  2.1 抗原表位的研究方法  12-18
  2.2 FMDV 抗原表位的研究进展  18-22
  2.3 FMD 表位疫苗的设计及优化  22-23
  2.4 表位疫苗研究存在的问题及展望  23-24
  2.5 本研究的目的和意义  24-25
第三章 FMDV AF/72 株结构蛋白 P1 及非结构蛋白 2ABC 基因的克隆和 B 细胞表位预测  25-45
  3.1 实验材料  25-26
  3.2 实验方法  26-30
  3.3 结果  30-39
  3.4 讨论  39-45
第四章 FMDV AF/72 株结构蛋白 VP2、VP3 和非结构蛋白 2C 的原核表达及多克隆抗体的制备  45-63
  4.1 实验材料  45
  4.2 实验方法  45-53
  4.3 结果  53-58
  4.4 讨论  58-63
第五章 FMDV AF/72 株结构蛋白 VP2、VP3 及非结构蛋白 2C 上 B细胞抗原表位的筛选  63-69
  5.1 实验材料  63
  5.2 实验方法  63-65
  5.3 结果  65-67
  5.4 讨论  67-69
第六章研究结论  69-71
参考文献  71-75
致谢  75-76
导师简介  76-77
作者简历  77

口蹄疫A型病毒AF/72株主要B细胞表位的筛选鉴定

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