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1.tmTNF-α通过TNFR2诱导凋亡的信号途径 2.抗体的制备及鉴定

作　者: 肖莉
导　师: 李卓娅
学　校: 华中科技大学
专　业: 免疫学
关键词: 跨膜型肿瘤坏死因子-α 分泌型肿瘤坏死因子-α NF-κB 肿瘤坏死因子受体2 凋亡 Caspase tmTNF-α sTNF-α 单克隆抗体 IgY 多克隆抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α),是一个多功能细胞因子,它以两种生物活性形式存在,即26kD的跨膜型TNF-α(tmTNF-α)和17kD的分泌型TNF-α(sTNF-α)。本实验室前期工作证实tmTNF-α比sTNF-α有更广的杀瘤谱,能杀死对sTNF-α耐受的肿瘤细胞株。TNF的大多数生物学效应由TNFR1介导,可引起细胞凋亡或通过激活核转录因子NF-κB使某些细胞增殖,其中sTNF-α主要与TNFR1结合发挥其生物学作用,而tmTNF-α则对表达TNFR1和TNFR2的靶细胞均有杀伤作用。由于tmTNF-α是TNFR2的主要配体,但是,其如何启动TNFR2凋亡信号尚未见报道。本研究以HepG2细胞为研究对象,探讨tmTNF-α如何通过TNFR2启动凋亡信号。主要结果如下:1.转染TNFR1 siRNA对两型TNF-α杀伤HepG2的影响:用TNFR1 siRNA阻断HepG2的TNFR1信号通路,对tmTNF-α诱导的胞毒作用和sTNF-α的促增殖作用影响不大,提示tmTNF-α主要通过TNFR2杀伤HepG2细胞。2.tmTNF-α介导NF-κB失活,而sTNF-α介导NF-κB活化:免疫共沉淀和Western blot结果显示tmTNF-α抑制TNFR2募集IKKα及IκB-α的降解;而sTNF-α则促进TNFR2募集IKKα及IκB-α的降解。提示tmTNF-α使NF-κB失活,而sTNF-α则激活NF-κB。3.tmTNF-α介导caspase活化:Western blot检测结果显示在tmTNF-α刺激24h后即可检测到HepG2内Caspase-8被剪切而活化。同时,Caspase-3含量也逐渐减少,并伴随PARP的剪切。然而,其它各caspase含量无明显变化。提示tmTNF-α通过激活Caspase-8和Caspase-3介导细胞凋亡。4.抑制蛋白合成对两型TNF-α胞毒作用的影响:用放线菌酮(CHX)抑制新的蛋白合成,可明显增加HepG2对sTNF-α胞毒效应的敏感性,却显著抑制该细胞对tmTNF-α胞毒效应的敏感性。提示sTNF-α杀伤HepG2需要抑制蛋白合成,反之,tmTNF-α杀伤之则需要合成新的蛋白质。5.tmTNF-α发挥胞毒效应需要合成促凋亡分子:用CHX抑制蛋白质合成,作用24h可导致Caspase-3含量减少,提示CHX可能通过抑制Caspase-3的合成而削弱tmTNF-α的胞毒效应。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)是一种主要由活化的T细胞、单核/巨噬细胞、NK细胞分泌的细胞因子,具有多种不同的生物学功能。TNF-α有两种活性形式,即26kD的跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α, tmTNF-α)和17kD的分泌型TNF-α(secreted TNF-α, sTNF-α)。由于目前的商业化抗体既针对sTNF-α,也可结合tmTNF-α,因此,无法区分两型TNF-α的生物学功能和病理作用。为此,本实验室前期已经成功制备出稳定分泌抗tmTNF-α抗体的杂交瘤细胞株C1,并构建了sTNF-α-pET原核高效表达系统,为本研究制备tmTNF-α单克隆抗体和sTNF-α兔抗人多克隆抗体及IgY多克隆抗体提供了重要的基础。一、tm-TNF-α单克隆抗体的制备与鉴定给雌性BALB/c小鼠提前一天注射不完全福氏佐剂,再腹腔接种2~5×105/只可分泌tmTNF-α抗体的杂交瘤细胞株C1,两周后收集小鼠腹水共82ml。先经辛酸-硫酸铵法粗提,再用Protein G亲和层析纯化。其鉴定结果如下:1.纯度鉴定:腹水经纯化后,总共得到约10ml,浓度为3mg/ml;SDS-PAGE分析仅见分子量约为52kD的重链及27kD的轻链。2.流式细胞术:用流式细胞术证实tmTNF-α单克隆抗体能与Raji细胞系表面的人tmTNF-α结合,表达率高达70%,与实验室前期制备的抗体结果一致。3.免疫印迹检测:用231注射BALB/c小鼠,取实体瘤进行Western blot检测,在26kD处有明显的条带,另有两条杂带,证明抗体制备成功。二、s TNF-α多克隆抗体的制备与鉴定IgY是鸡的卵黄免疫球蛋白的简称(Immunoglobulin of egg yolk, IgY),通过皮下注射特异性的抗原,鸡可产生相应的特异性抗体,并从母鸡血液中的免疫球蛋白传递至鸡卵黄,并在孵育过程和孵育后对子鸡起保护作用的免疫球蛋白,这种从蛋黄中提取的抗体称为IgY。由于IgY可与抗原上的更多表位发生反应,起到信号放大作用,因此可提高免疫学诊断的敏感性。鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)作为一种高产量高效的抗体,已被广泛应用于医学各个领域。本课题用原核细胞表达的人sTNF-α重组蛋白分别免疫家兔和莱杭母鸡,获得兔抗人sTNF-α多克隆抗体及鸡抗人sTNF-αIgY多克隆抗体。其鉴定如下:1.兔抗人sTNF-α多克隆抗体鉴定1.1抗体总量:两只白兔总共得到兔血清约50ml。1.2ELISA检测其效价:用sTNF-α融合蛋白包被孔板,用兔血清作为检测抗体,抗体效价可以达到1:16000。1.3免疫印迹检测:取Raji细胞总蛋白进行Western blot,用抗TNF兔多抗检测证实在22kD左右有明显的条带。2. IgY抗体鉴定2.1抗体总量:一只莱杭母鸡最后获得抗体量约150ml,浓度2mg/ml。2.2 ELISA检测其效价:用sTNF-α融合蛋白包被孔板,用IgY作为检测抗体,抗体效价可以达到1:1600,并持续到50天效价维持在1:800。2.3免疫印迹检测:取sTNF-pET-BL-21菌菌体总蛋白方法进行Western blot,用IgY作为检测抗体,在1:2000时仍有很明显的条带。2.4荧光共聚焦显微镜检测TNF-α表达:分别用IgY与抗tmTNF-α单抗进行荧光共聚焦显微镜检测,可以发现FITC标记的IgY的呈绿色荧光,而PE标记的tmTNF-α呈红色荧光。上述结果证实我们成功制备与纯化tmTNF-α单抗、抗TNF-α的兔多抗与鸡多抗,可用于荧光检测、FACS和免疫印迹检测等,为研究两型TNF-α提供了有力的实验工具。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)主要由活化的T细胞、单核/巨噬细胞和NK细胞产生并分泌,具有免疫调节和抗肿瘤作用等多种生物学效应的细胞因子。TNF-α是以三聚体形式发挥作用。由于TNF的超家族分子在结构上唯一的共同之处是其高度保守的结构域,因此我们推测TNF超家族成员形成三聚体可能和氨基酸序列中高度保守的序列有关。在此研究中,我们利用重叠PCR制备缺失保守序列119-126位氨基酸(△119-126)的突变体,为后期三聚体实验工作做准备。主要结果如下:1.重组体的构建和克隆:以pcDNA3.0-wtTNF-α质粒为模板,用重叠PCR缺失119-126位氨基酸(△119-126),用BamHI和XhoI对此目的基因和pcDNA3.0空载体双酶切,再T4 DNA连接酶连接,获得突变体-pcDNA3.0重组质粒,然后将连接产物转化DH5α,挑取阳性克隆进行鉴定。2.阳性克隆的鉴定:用菌落PCR初步筛选阳性克隆,然后用上述限制性内切酶双酶切进行鉴定,结果显示重组体经过酶切后,得到了约700bp左右的目的片断,与连接的目的基因的大小一致。再进一步用DNA测序分析,证实重组体突变成功。

全文目录

英文缩略词表  5-7
第一部分 tmTNF-α 通过 TNFR2 诱导凋亡的信号途径  7-32
  中文摘要  7-8
  Abstract  8-9
  前言  9-12
  材料与方法  12-21
  结果  21-26
  讨论  26-29
  小结  29-30
  参考文献  30-32
第二部分抗体的制备及鉴定  32-62
  中文摘要  32-34
  Abstract  34-36
  Ⅰ.tmTNF-α 单克隆抗体的制备与鉴定  36-45
    前言  36
    材料和方法  36-40
    结果  40-42
    讨论  42-45
    小结  45
  Ⅱ.sTNF-α 多克隆抗体的制备与鉴定  45-58
    前言  45
    材料与方法  45-51
    结果  51-55
    讨论  55-57
    小结  57-58
  参考文献  58-62
第三部分重组质粒 pcDNA3.0-△119-126 TNF-α 的构建  62-78
  中文摘要  62-63
  Abstract  63-64
  前言  64-65
  材料与方法  65-71
  结果  71-75
  讨论  75-76
  小结  76
  参考文献  76-78
综述  78-99
  参考文献  86-99
致谢  99

1.tmTNF-α通过TNFR2诱导凋亡的信号途径 2.抗体的制备及鉴定

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