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家蚕SCI-SB基因克隆及其原核表达的研究

作　者: 张苗
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 SCI-SB基因原核表达胰凝乳蛋白酶抑制剂多克隆抗体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

根据NCBI已经报道的SCI-SB的mRNA序列,自行设计一对特异性引物,利用RT-PCR 扩增获得 SCI-SB 的cDNA片段,将该片段连接到原核表达载体pGEX4T-1中,经PCR、酶切鉴定以及测序分析,证实成功构建了重组表达载体pGEX4T-1-SCI-SB。用已构建的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆培养,IPTG 诱导后裂解菌作SDS-PAGE 分析,在34 kD处有一特异性蛋白条带,与预期值相符。表达量可达菌体总蛋白的15%左右。融合蛋白以包涵体的形式存在,超声波裂解菌体分离包涵体并离心、洗涤;用20%Sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体,采用亲和层析纯化了融合蛋白GST-SCI-SB。胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性抑制实验表明,该融合蛋白具有一定的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶活性抑制作用。质谱分析表明,与rSCI-SB期望氨基酸序列基本一致,。以该融合蛋白为抗原免疫两只雄性新西兰大白兔制作了该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗体血清的效价可达到1.56x10~-4(1:6400)以上。Western印迹实验呈阳性,进一步证实了重组蛋白的表达。

全文目录

中文摘要  8
关键词：  8-9
第一部分文献综述与实验设计  9-24
  第一章蛋白酶抑制剂研究进展  10-22
    1.蛋白酶抑制剂的种类及其分布  10-11
    2.蛋白酶抑制剂的作用  11-14
      2.1 防御作用  11-12
      2.2 调节内在的蛋白酶的平衡  12
      2.3 蛋白酶抑制剂作用机制  12-14
    3.蛋白酶抑制剂的应用  14-17
      3.1 基础研究方面  14-15
      3.2 蛋白酶抑制剂与农业  15
      3.3 蛋白酶抑制剂与医学  15-17
        3.3.1 蛋白酶抑制剂与HIV  15-16
        3.3.2 蛋白酶抑制剂与肿瘤  16-17
        3.3.3 其他方面的应用  17
    4.家蚕蛋白酶抑制剂  17-20
      4.1 家蚕体液中蛋白酶抑制剂的种类  17-19
      4.2 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂SCI-SB概述  19-20
        4.2.1 SCI-SB的发现  19
        4.2.2 SCI-SB多肽  19-20
    5.研究展望  20-22
  第二章实验设计方案  22-24
    1.实验目的和意义  22
    2.研究内容  22-23
    3.实验流程图  23-24
第二部分研究论文  24-56
  第一章重组表达载体的构建  25-37
    1.材料和试剂  25
    2.实验方法  25-32
      2.1 家蚕总RNA提取及cDNA合成  25-28
      2.2 低熔点胶回收、纯化PCR产物  28
      2.3 PCR产物双酶切  28-29
      2.4 限制性内切酶热失活  29
      2.5 载体pGEX4T-1双酶切  29
      2.6 连接反应  29
      2.7 重组表达载体的鉴定  29-32
    3.结果  32-36
      3.1 家蚕总RNA琼脂糖电泳检测  32
      3.2 RT-PCR扩增家蚕SCI-SB cDNA  32-33
      3.3 重组表达载体的构建  33-36
        3.3.1 表达载体pGEX4T-1的图谱  33-34
        3.3.2 重组表达载体pGEX4T-1-SCI-SB的构建策略  34
        3.3.3 重组表达载体pGEX4T-1-SCI-SB的鉴定  34-35
        3.3.4 重组表达载体pGEX4T-1-SCI-SB测序结果  35-36
    4.讨论  36-37
  第二章 pGEX4T-1-SCI-SB在大肠杆菌中的诱导表达  37-42
    1.试剂和材料  37-38
    2.实验方法  38-40
      2.1 融合蛋白在大肠杆菌中的表达  38-39
      2.2 SDS-PAGE电泳分析  39
      2.3 融合蛋白表达量的确定  39
      2.4 工程菌株BL21-pGEX4T-1-SCI-SB的保存  39-40
    3.结果  40-41
      3.1 BL21-pGEX4T-I-SCI-SB不同时间的诱导表达  40
      3.2 BL21-pGEX4T-1-SCI-SB表达形式的确定  40-41
    4.讨论  41-42
  第三章重组蛋白纯化和活性测定  42-50
    1.材料与试剂  42-43
    2.实验方法  43-45
      2.1 包涵体的复性  43
      2.2 GST亲和柱层析  43-44
      2.3 质谱鉴定分析  44
      2.4 测定融合蛋白蛋白酶抑制剂活力  44-45
    3.结果  45-49
      3.1 表达产物的亲和纯化及检测  45
      3.2 融合蛋白蛋白酶抑制剂的活性测定  45-46
      3.3 质谱鉴定分析  46-49
    4.讨论  49-50
  第四章抗体制备及效价测定  50-56
    1.材料与试剂  50-51
    2.实验方法  51-54
      2.1 抗体制备  51-52
        2.1.1 抗原制备  51
        2.1.2 免疫动物  51-52
        2.1.3 抗体血清制备  52
      2.2 抗体的效价测定(ELISA)  52-53
      2.3 融合蛋白的Western blotting鉴定  53-54
    3.结果  54-55
      3.1 抗体的效价测定  54
      3.2 Western blotting检测实验  54-55
    4.讨论  55-56
结论  56-57
参考文献  57-62
ABSTRACT  62-63
附:硕士期间发表的文章  63

家蚕SCI-SB基因克隆及其原核表达的研究

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