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猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达及其抗猪瘟病毒活性的研究

作　者: 黄志清
导　师: 林爱星
学　校: 中国农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 猪干扰素-γ 毕赤酵母 分泌表达 猪瘟病毒 抗病毒活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 281次
引　用: 4次
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内容摘要


猪干扰素-γ(PoIFN-γ)是由激活的T细胞和NK细胞产生的一类细胞因子,它具有高效抗病毒和免疫调节作用,有广阔的应用前景。为了更好地利用基因工程技术来开发重组猪干扰素-γ制剂,本研究将去除信号肽的猪干扰素-γ cDNA基因置于酿酒酵母α因子分泌信号的DNA序列后,构建成能精确分泌表达PoIFN-γ蛋白的重组表达载体pPIC9K-α-PoIFN-γ,通过电转化导入毕赤酵母GS115中,采用G418进行筛选,获得了两株能够高效分泌表达PoIFN-Y的多拷贝插入重组子。提取重组子的基因组DNA,采用PCR方法对重组子进行鉴定,结果表明PoIFN-γ成熟多肽基因成功整合到宿主菌的基因组中。重组子经甲醇诱导表达96h后,离心培养物,取上清用75%硫酸铵4℃沉淀过夜,再用PBS(pH7.4)透析24h,然后进行SDS-PAGE和Western blot分析,结果表明所获得的两株重组子都能分泌表达出17kD和23kD左右的PoIFN-γ特异蛋白,表达量分别为105mg/L和108mg/L,约占培养液总蛋白的60%。采用PK-15/HCV系统对其中一株重组子的分泌表达产物进行抗病毒活性研究,结果表明所获得的重组PoIFN-γ能够很好地保护猪肾细胞(PK-15株)免受猪瘟病毒HCV(石门系)的感染。 本研究首次在毕赤酵母表达系统中以分泌形式表达出重组PoIFN-γ,为利用基因工程手段开发重组猪干扰素-γ制剂打下了良好的基础。

全文目录


第一部分 文献综述  8-20
  综述一 毕赤酵母表达系统的研究进展  8-16
    1 毕赤酵母表达系统的优点  8-9
    2 毕赤酵母的生物学特点  9
    3 毕赤酵母表达载体  9-10
    4 毕赤酵母表达宿主菌  10-11
    5 毕赤酵母的转化  11
    6 质粒在毕赤酵母中的重组和整合  11-13
    7 外源蛋白在毕赤酵母中的分泌表达  13
    8 α因子分泌信号的切除  13-14
    9 影响外源蛋白表达水平的因素  14-16
  综述二 猪干扰素-γ的研究进展  16-20
    1 干扰素概况  16-18
    2 猪干扰素-γ的研究进展  18-20
第二部分 实验部分  20-51
  实验一 毕赤酵母重组表达载体pPIC9K-α-PoIFN-γ的构建  20-35
    1 材料与方法  20-28
    2 结果与分析  28-33
    3 讨论  33-35
  实验二 猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达  35-47
    1 材料与方法  35-43
    2 结果与分析  43-46
    3 讨论  46-47
  实验三 重组猪干扰素-γ蛋白抗猪瘟病毒活性的研究  47-51
    1 材料与方法  47-48
    2 结果与分析  48-50
    3 讨论  50-51
结论  51
展望  51-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
附录  59-61

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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