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壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

作　者: 阳丽
导　师: 王曼莹
学　校: 江西师范大学
专　业: 生物化工
关键词: 壳聚糖内切酶毕赤酵母酶活性高效表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以烟曲霉(Aspergillus fumigatus)分泌的壳聚糖内切酶为研究对象,将其成熟基因成功克隆后,经电转化导入毕赤酵母中实现高效表达。壳聚糖内切酶是专一性降解壳聚糖生成水溶性壳聚糖与壳寡糖的最理想的生物催化剂,是替代当前普遍采用强酸等化学降解工艺的急需工业酶。为了实现其高效表达,本文对几个关键问题进行研究,特别注重重组毕赤酵母发酵条件的优化,获得的研究资料为壳聚糖内切酶的生产提供了依据。第一,研究了壳聚糖内切酶基因电转化到毕赤酵母中的最佳方式。确定了重组毕赤酵母表达载体pPIC9K-Csn经Sa1I线性化后电转化入表达宿主GS115。第二,研究了多重组子的筛选。采用不同浓度的抗生素G418筛选多重组子,发现在4mg/mL的G418中筛选多重组子效果较好。经PCR分析后表明,壳聚糖内切酶基因在GS115中得到了正确的高效表达。经酶活检测,实验室摇瓶发酵时,多重组子在毕赤酵母中表达的酶活最高可达67.93U/mL。经SDS-PAGE测定,表达产物的分子量为25KD。第三,对重组毕赤酵母发酵条件进行了优化。经过两个发酵阶段的条件优化实验:(1)生长阶段的最佳发酵工艺为:甘油1.0%(v/v),硫酸铵2.5%(w/v),Biotin 0.00004%(w/v),lmol/L磷酸缓冲液10%(v/v),pH5.5,在250mL的三角瓶里装液量为20mL,在30℃,220rpm条件下培养48h,接种量为1%。(2)诱导阶段的最佳发酵工艺为:甲醇0.5%(v/v),甘油0.25%(v/v),硫酸铵2.0%(w/v),Biotin 0.00004%(w/v),lmol/L磷酸缓冲液10%(v/v),pH6.0,在250mL的三角瓶里装液量为20mL,每隔24h补加一次初始浓度的甲醇和甘油,在30℃,220rpm条件下诱导培养48h,接种比率为1:l。验证实验表明,建立高密发酵生产条件,可获得更为理想的表达效果。在最佳发酵条件下,壳聚糖内切酶产量平均可达107.07U/mL。以上研究结果表明,本研究构建的基因工程菌在毕赤酵母中成功表达,并筛选出多重组子。实验室摇瓶发酵时,酶活可达67.93U/mL。在高密发酵生产条件下,可获得更为理想的表达效果。因此该工程菌所产的壳聚糖内切酶有广阔的工业化生产和应用前景。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
缩略语表  7-11
第一章绪论  11-29
  1.1 壳聚糖的研究  11
  1.2 壳聚糖内切酶的研究进展  11-15
    1.2.1 壳聚糖内切酶的发现  11
    1.2.2 壳聚糖内切酶的分类  11-12
    1.2.3 壳聚糖内切酶的分布  12-13
    1.2.4 壳聚糖内切酶的理化性质  13-14
    1.2.5 壳聚糖内切酶的应用  14-15
  1.3 毕赤酵母表达系统的研究进展  15-28
    1.3.1 毕赤酵母表达系统  15-20
    1.3.2 外源蛋白在毕赤酵母中的表达  20-28
  1.4 本课题的研究目的、意义与创新点  28-29
第二章壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的重组及筛选多重组子  29-41
  2.1 实验材料  29-33
    2.1.1 菌株与质粒  29
    2.1.2 酶  29
    2.1.3 引物  29-30
    2.1.4 主要试剂  30
    2.1.5 主要培养基  30-31
    2.1.6 主要溶液  31
    2.1.7 酵母表达常用溶液母液的配制  31-32
    2.1.8 主要设备  32-33
  2.2 实验方法  33-37
    2.2.1 载体pPIC9K-Csn 的线性化  33-35
    2.2.2 酵母菌的电转化  35
    2.2.3 毕赤酵母重组子甲醇利用表型的鉴定  35
    2.2.4 煮—冻—煮法鉴定阳性克隆子  35-36
    2.2.5 多克隆子的筛选  36-37
    2.2.6 菌种保存  37
  2.3 实验结果  37-40
    2.3.1 pPIC9K-Csn 线性化  37
    2.3.2 重组子的筛选  37-38
    2.3.3 高抗性重组菌株的筛选  38-39
    2.3.4 阳性克隆的鉴定  39-40
  2.4 讨论  40
    2.4.1 重组质粒pPIC9K-Csn 线性化原因  40
    2.4.2 巴斯德毕赤酵母的转化方法的选择  40
    2.4.3 表达系统的选择  40
  2.5 小结  40-41
第三章酵母重组子的诱导表达和分析  41-49
  3.1 实验材料  41-43
    3.1.1 菌株  41
    3.1.2 主要试剂  41
    3.1.3 主要培养基  41-42
    3.1.4 主要溶液  42-43
    3.1.5 主要设备  43
  3.2 实验方法  43-46
    3.2.1 酵母重组子的诱导表达和分析  43-45
    3.2.2 诱导产物的SDS-PAGE 电泳检测  45-46
  3.3 实验结果  46-48
    3.3.1 重组酵母菌株生长曲线的测定  46-47
    3.3.2 重组菌株诱导表达产物的酶活性的测定  47
    3.3.3 重组菌株诱导表达产物SDS-PAGE 的测定  47-48
  3.4 讨论  48
  3.5 小结  48-49
第四章重组毕赤酵母发酵条件的优化  49-65
  4.1 实验材料  49
    4.1.1 主要试剂  49
    4.1.2 主要培养基  49
    4.1.3 主要设备  49
  4.2 实验方法  49-54
    4.2.1 酵母细胞密度测定  49
    4.2.2 酶活测定  49
    4.2.3 碳源的影响  49-50
    4.2.4 氮源的影响  50-51
    4.2.5 培养基pH 值的影响  51
    4.2.6 接种量的影响  51-52
    4.2.7 通气量对菌体生物量和产酶的影响  52-53
    4.2.8 温度对菌体生物量和产酶的影响  53
    4.2.9 甲醇对菌体生物量和产酶的影响  53-54
    4.2.10 正交实验优化发酵条件  54
    4.2.11 正交实验的验证  54
  4.3 实验结果  54-63
    4.3.1 碳源对生长期菌体和诱导期产酶的影响  54-56
    4.3.2 氮源对生长期菌体和诱导期产酶的影响  56-57
    4.3.3 培养基pH 值对生长期菌体和诱导期产酶的影响  57-58
    4.3.4 接种量对生长期菌体和诱导期产酶的影响  58-59
    4.3.5 通气量对菌体生物量和诱导期产酶的影响  59-60
    4.3.6 温度对菌体生物量和诱导期产酶的影响  60-61
    4.3.7 甲醇对菌体生物量和诱导期产酶的影响  61-62
    4.3.8 正交实验优化发酵条件  62-63
    4.3.9 正交实验的验证  63
  4.4 讨论  63-64
    4.4.1 诱导阶段甘油含量  63
    4.4.2 诱导阶段接种量  63
    4.4.3 诱导阶段甲醇含量  63-64
    4.4.4 诱导时间  64
  4.5 小结  64-65
总结  65-66
展望  66-67
参考文献  67-73
致谢  73-74
硕士期间在校发表论文和参与的科研情况  74

壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

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