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共表达γ干扰素的猪细小病毒与猪乙型脑炎病毒核酸疫苗的构建及其免疫原性研究

作　者: 叶茂
导　师: 郭万柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪γ干扰素 核酸疫苗 乙型脑毒 猪细小病毒 免疫原性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 105次
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内容摘要


本实验为构建和筛选良好的猪乙型脑炎和猪细小病毒的核酸疫苗,并提高核酸疫苗的免疫效果,用重叠PCR法把PPV VP2和JEV E10连接起来,得到重组质粒pcDNA.VE,再设计—对特异性引物扩增IFN-γ并插入载体pcDNA.VE,构建含有PPV VP2基因、JEV E10基因和IFN-γ基因的重组质粒pcDNA.VEI,并使其共同表达。用脂质体将pcDNA.VEI介导入Vero细胞,通过间接免疫荧光法检测目的基因的体外表达,观察细胞绿色荧光。用pcDNA.VEI和不表达IFN-γ的pcDNA.VE分别免疫Balb/c小鼠,同时设立PBS、猪细小病毒灭活疫苗、乙型脑炎弱毒疫苗和pcDNA3.1空白质粒免疫对照组。共免疫两次,间隔2周检测免疫指标。观测脾淋巴细胞增殖、通过ELISA观测免疫小鼠的抗体水平,并进行T细胞亚群动态监测。结果显示,通过鉴定核酸疫苗的构建达到了预期目标,并可在荧光显微镜下观察到了其转染的Vero细胞。该核酸疫苗能够诱导脾淋巴细胞增殖。ELISA结果显示,与pcDNA.VE和阴性对照组进行比较,pcDNA.VEI所诱导产生的两种抗体都较高。在首免后2周时还不明显,但随后抗体水平逐渐增高,第4周时抗体水平显示出明显增高。pcDNA.VEI组能较稳定的诱导产生T细胞亚群,并检测到CD4+/CD8+比例于首免2周后都高于pcDNA.VE。结果表明：共表达γ干扰素的乙型脑炎病毒与猪细小病毒核酸疫苗构建成功,并能产生特异诱导体液免疫和细胞免疫,在小鼠免疫试验中IFNγ基因在核酸疫苗中发挥了免疫增强效果,为乙脑和猪细小病毒核酸疫苗研究提供了实验依据。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章 文献综述  9-23
  1 日本乙型脑炎病毒概述  9-13
    1.1 日本乙型脑炎病毒发生与流行特点  9
    1.2 日本乙型脑炎病毒病原学  9-11
      1.2.1 日本乙型脑炎病原特性  9-10
      1.2.2 日本乙型脑炎病毒基因组结构  10-11
      1.2.3 日本乙型脑炎病毒基因组产物  11
    1.3 乙脑病毒病疫苗研究进展  11-13
      1.3.1 灭活疫苗  11-12
      1.3.2 减毒活疫苗  12
      1.3.3 基因工程疫苗  12-13
  2 猪细小病毒概述  13-19
    2.1 猪细小病毒病的发生与流行特点  13-14
    2.2 猪细小病毒病原学  14-16
      2.2.1 猪细小病毒病原特性  14-15
      2.2.2 猪细小病毒基因组结构  15
      2.2.3 猪细小病毒基因组产物  15-16
    2.3 猪细小病毒病疫苗研究进展  16-19
      2.3.1 常规疫苗  16-17
      2.3.2 新型疫苗  17-19
  3. IFN-γ文献综述  19-22
    3.1 IFN-γ的结构和特点  19-20
    3.2 IFN-γ的产生和调节  20
    3.3 IFN-γ的生物学功能  20-21
    3.4 IFN-γ的免疫增强作用  21
    3.5 问题与展望  21-22
  4. 本研究的目的和意义  22-23
第二章 共表达γ干扰素的乙型脑炎病毒与猪细小病毒核酸疫苗的构建及其免疫原性研究  23-58
  1. 实验材料  23-25
    1.1 质粒、菌株及细胞  23
    1.2 主要药品与试剂  23
    1.3 培养基  23-24
    1.4 主要溶液的配制  24
    1.5 试验动物  24-25
    1.6 主要仪器  25
  2 试验方法  25-40
    2.1 IFN-γ基因的克隆与鉴定  25-29
      2.1.1 IFN-γ基因引物的设计与合成  25-26
      2.1.2 质粒pMD-N-IFN-γ的抽提  26
      2.1.3 IFN-γ基因的PCR  26-27
      2.1.4 IFN-γ基因的回收  27
      2.1.5 IFN-γ基因的克隆及鉴定  27-29
    2.2 含PPV和JEV基因的质粒PCDNA-VE的构建  29-33
      2.2.1 重叠PCR连接VP2和E10基因的引物的设计与合成  29-30
      2.2.2 VP2-E10基因的重叠PCR  30-31
      2.2.3 重组基因pMD-VE的回收  31
      2.2.4 重组质粒pMD-VE的克隆及鉴定  31-33
      2.2.5 重组质粒pcDNA.VE的构建  33
    2.3 含有IFN-γ、PPV和JEV的重组质粒pcDNA.VEI的构建  33-36
      2.3.1 pcDNA-VE与pMD-IFN-γ的酶切回收  33-34
      2.3.2 连接与转化  34
      2.3.3 重组质粒的酶切鉴定  34
      2.3.4 重组质粒的序列测定  34-36
    2.4 PCDNA.VEI质粒DNA转染VERO细胞  36-37
      2.4.1 pCDNA.VEI质粒DNA的抽提与纯化  36-37
      2.4.2 pCDNA.VEI质粒DNA转染Vero细胞表达与鉴定  37
    2.5 PCDNA.VEI核酸疫苗的免疫原性研究  37-40
      2.5.1 试验设计  37-38
      2.5.2 免疫小鼠血清抗体的ELISA检测  38-39
      2.5.3 脾淋巴细胞增殖反应试验  39-40
      2.5.4 小鼠T细胞亚群动态监测  40
  3 试验结果  40-51
    3.1 质粒PMD-IFN-γ的鉴定  40-42
      3.1.1 质粒pMD-IFN-γ的PCR鉴定  40-41
      3.1.2 质粒pMD-IFN-γ的酶切鉴定  41-42
      3.1.3 质粒pMD-IFN-γ的序列测定  42
    3.2 质粒PCDNA.VE的鉴定  42-43
    3.3 质粒PCDNA.VEI的鉴定  43-44
    3.4 质粒PCDNA.VEI的序列测定  44-45
    3.5 PCDNA.VEI质粒DNA转染VERO细胞的荧光观察  45-46
    3.6 PCDNA.VEI核酸疫苗的免疫原性研究  46-51
      3.6.1 抗体检测  46-48
      3.6.2 脾细胞增殖试验  48-49
      3.6.3 T细胞亚群数量的检测  49-51
  4 讨论  51-56
    4.1 核酸疫苗的构建  51-54
      4.1.1 核酸疫苗的优点和存在问题  51-52
      4.1.2 提高核酸疫苗免疫水平的策略  52-54
    4.2 抗原表位的选择  54-55
    4.3 γ干扰素的免疫增强效应  55-56
    4.4 影响DNA疫苗的免疫效果的其他因素  56
  5 结论  56-58
参考文献  58-65

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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