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抗鹅膏肽的全合成及其活性测定

作　者: 谢进
导　师: 曹福祥
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 抗鹅膏肽 自动合成 环化 高效液相色谱 纯化 活性检测
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 37次
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内容摘要


抗鹅膏肽(Antamananide)是一种源自毒鹅膏(Amanita phalloides)的无毒环十肽,其氨基酸残基组成为环-(一Phe-Pro-Pro-Phe-Phe-Val-Pro-Pro-Ala-Phe),它是毒蕈肽和毒伞毒素转运系统的竞争性抑制剂,因此对抗鹅膏肽进行研究具有重要的意义。本实验通过多肽自动合成仪合成抗鹅膏肽直链前体后,采用手动合成抗鹅膏肽,并对其进行制备、检测分析,对制备后的抗鹅膏肽进行活性测定,其研究结果如下：(1)本实验对抗鹅膏肽直链前体的合成采用的是日本岛津PSSM-8型多肽自动合成仪合成,在对其反应程序进行优化和改进后,其得率可达93%。抗鹅膏肽直链前体的自动合成原理与固相人工合成原理相同,与固相人工合成相比自动合成的优势有：安全,实验周期短,缩合率高,得率高等。并对抗鹅膏肽直链前体进行测序分析,代替质谱分析,提高了合成序列的可信度。(2)对于抗鹅膏肽直链前体的环化方法,本实验分别采用了DCC-HOBt法,DPPA法和DMF法,对抗鹅膏肽直链前体进行环化,并对环化结果进行分析比对,得出DPPA法是其中最有效的环化方法,可获得纯度为35.55%的抗鹅膏肽。在对抗鹅膏肽的制备分离纯化后,可得到纯度为93.3%的抗鹅膏肽样品。(3)本实验对抗鹅膏肽直链前体样品和抗鹅膏肽样品进行检测,通过紫外分光光度计的波长扫描得220nm为两种样品的最佳检测波长；通过红外光谱分析得到两种样品官能团骨架,各种键之间的伸缩振动和变形振动的异同,较为系统的对两者的结构,性质进行了分析比对。(4)在对抗鹅膏肽的活性测定部分,使用的是毒性比鹅膏肽较小的鬼笔环肽,其LD50在1.8-2.2mg/kg,在对小鼠进行肌肉注射鬼笔环肽毒素后36h,对照组小鼠死亡,而同时注射抗鹅膏肽样品的实验组小鼠的死亡时间推后了12h。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-11
1 绪论  11-27
  1.1 多肽概述  11
  1.2 生物活性多肽的应用  11-12
    1.2.1 功能性食品  11
    1.2.2 生物医药  11-12
    1.2.3 科学研究  12
  1.3 多肽合成  12-18
    1.3.1 多肽合成的发展  12-13
    1.3.2 肽键的形成  13-14
    1.3.3 固相多肽合成(SPPS)的原理  14-18
  1.4 环肽的合成  18-22
    1.4.1 纯环肽的合成  18-20
    1.4.2 杂环肽的合成  20-21
    1.4.3 影响环化产率的因素  21-22
  1.5 多肽的分离纯化  22-23
  1.6 多肽的鉴定  23
  1.7 环肽的发展前景与展望  23-24
  1.8 本论文研究的目的意义  24-27
2. 原料纯度的检测  27-31
  2.1 实验仪器与试剂  27
    2.1.1 仪器  27
    2.1.2 试剂  27
  2.2 实验方法  27-28
    2.2.1 样品溶液的配制  27
    2.2.2 流动相的配制  27-28
    2.2.3 原材料色谱分析的条件  28
  2.3 结果与分析  28-30
    2.3.1 波长的选择  28-29
    2.3.2 原料纯度色谱分析结果  29-30
  2.4 小结  30-31
3. 抗鹅膏肽直链前体的合成及检测  31-44
  3.1 实验试剂与仪器  31-32
    3.1.1 仪器  31-32
    3.1.2 试剂  32
  3.2 实验方法  32-37
    3.2.1 PSSM-8多肽合成仪的简介及程序的设定  32-34
    3.2.2 PPSQ-31A/33A蛋白质测序仪  34-35
    3.2.3 分析检测方法和条件  35-36
    3.2.4 树脂的活化及氨基酸、缩合剂的称取  36
    3.2.5 Fmoc-Phe-OH与王氏树脂连接  36
    3.2.6 自动合成树脂抗鹅膏肽直链前体  36
    3.2.7 多肽合成的后处理  36-37
  3.3 结果与分析  37-42
    3.3.1 实验步骤的完善  37
    3.3.2 检测波长的选择  37
    3.3.3 流动相的选择  37-38
    3.3.4 抗鹅膏肽直链前体的色谱图分析  38
    3.3.5 抗鹅膏肽直链前体的测序分析  38-42
  3.4 小结  42-44
4. 抗鹅膏肽直链前体成环  44-51
  4.1 主要仪器和试剂  44-45
    4.1.1 仪器  44
    4.1.2 试剂  44-45
  4.2 实验方法  45-46
    4.2.1 DCC-HOBT法  45
    4.2.2 DPPA法  45
    4.2.3 DMF法  45
    4.2.4 分析检测方法和条件  45-46
  4.3 结果与分析  46-49
    4.3.1 实验步骤的优化  46
    4.3.2 缩合剂的比较  46-47
    4.3.3 粗环肽的色谱鉴定及分析  47-49
  4.6 小结  49-51
5. 抗鹅膏肽的初步纯化制备及检测  51-58
  5.1 主要仪器和试剂  51
    5.1.1 仪器  51
    5.1.2 试剂  51
  5.2 实验方法  51-52
    5.2.1 使用712型反相高效液相色谱仪的分离条件  51-52
    5.2.2 使用SHIMADZU 2010型高效液相色谱仪的分离条件  52
    5.2.3 制备后的样品干燥  52
    5.2.4 抗鹅膏肽直链前体和抗鹅膏肽样品的紫外光谱分析  52
    5.2.5 抗鹅膏肽直链前体和抗鹅膏肽样品的红外光谱分析  52
  5.3 结果与分析  52-57
    5.3.1 粗环肽的色谱鉴定及分析  53-55
    5.3.2 抗鹅膏肽直链前体和抗鹅膏肽样品紫外吸收光谱分析  55-56
    5.3.3 抗鹅膏肽直链前体和抗鹅膏肽样品红外吸收光谱分析  56-57
  5.4 小结  57-58
6 抗鹅膏肽的活性测定  58-60
  6.1 实验仪器及材料  58
    6.1.1 仪器  58
    6.1.2 材料  58
    6.1.3 试剂  58
  6.2 实验方法  58-59
    6.2.1 均衡条件  58
    6.2.2 注射毒素及样品  58-59
  6.3 结果与分析  59
  6.4 小结  59-60
7. 结论与展望  60-62
  7.1 结论  60-61
  7.2 展望  61
  7.3 创新点  61-62
参考文献  62-68
附录A:缩略词表  68-69
附录B  69-70
致谢  70

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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