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纳豆菌液体发酵产生纤溶酶的研究

作　者: 田艳
导　师: 鲍时翔
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 纳豆 纳豆菌 纤溶酶 液体发酵 分离纯化
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
下　载: 249次
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内容摘要


心血管疾病是一种严重危害老年人健康的常见疾病，溶血栓疗法是这类疾病重要的治疗方法之一。由于现用溶栓药或多或少都有一些缺陷，因此人们一直都在研制开发新型的溶血栓药物。其中，从日本的传统食品纳豆中分离出具有纤溶活性的纳豆激酶，引起了人们的极大兴趣。 本研究利用本实验室保存的，从纳豆中分离出的有纤溶活性的菌株Bacillus.natto. strain B-2023，对其液体发酵产生纤溶酶（暂命名为BH-1）的条件进行了优化，用自制的猪血浆平板测酶的活性，得出以下结果： 最优氮源是大豆蛋白胨，2％的氮源利于产酶；最优碳源是木糖，2％的碳源利于产酶；碳氮比以1∶1合适；离子中以Ca2+的影响最大，0.02％利于产酶；磷酸盐以Na2HPO40.2％；NaH2PO40.1％为优；表面活性剂的添加有助于酶的分泌，添加量和添加时间十分重要，以0.1％的油酸钠在12h时加入为好；35℃、pH7利于产酶；装液量20ml/100ml，接种量以2％为佳，种子种龄为24h。这样的条件下发酵产酶，获得的纤溶酶用纤维蛋白平板测活，UK标准曲线作对照，其产酶量为786IU/ml，是最初的2倍多。 将发酵上清液经粗分级分离和Sephadex G-100凝胶过滤，得到具有纤溶活性的柱层析产物BH-1。BH-1经SDS-PAGE蛋白电泳，在凝胶约28KD的位置显单一条带，推测它可能为单链蛋白。 BH-1的稳定性在25℃和37℃时较好，55℃以上迅速失活；其最适pH为7.0，在pH7.0～8.0范围内稳定性较好。用普通的纤维蛋白平板，以及80℃加热使纤溶酶原失活的纤维蛋白平板作对比试验，发现BH-1在两种平板上的溶圈直径一样大，可判定BH-1直接作用于纤维蛋白，而不是纤溶酶原的激活剂。

全文目录


中文摘要  5-6
一、 序言  6-21
  1． 血栓栓塞性疾病与治疗  6-12
    1．1 血栓栓塞性疾病  6-7
    1．2 血栓栓塞性疾病的治疗  7-12
      1．2．1 溶栓药物  7-12
        1．2．1．1 首代溶栓药物  8-9
        1．2．1．2 第二代溶栓药物  9-11
        1．2．1．3 第三代溶栓药物  11-12
  2 纳豆  12-20
    2．1 纳豆的生产  13-14
    2．2 纳豆的成分  14-15
    2．3 纳豆的功能  15-20
      2．3．1 降血压  15
      2．3．2 抗肿瘤  15-16
      2．3．3 纳豆与骨质疏松症  16
      2．3．4 纳豆中的枯草溶血素及其功能  16-17
      2．3．5 抗菌  17
      2．3．6 溶血栓性  17-20
        2．3．6．1 纳豆菌  17-18
        2．3．6．2 纳豆激酶  18-20
  3 本研究的意义和主要内容  20-21
二、 材料与方法  21-28
  1 材料  21-22
    1．1 纳豆菌  21
    1．2 培养基  21
    1．3 主要试剂  21-22
    1．4 主要仪器设备  22
  2． 方法  22-28
    2．1 纳豆菌的培养方法  22-23
      2．1．1 纳豆菌的平板培养  22
      2．1．2 纳豆菌的液体培养  22
      2．1．3 纳豆菌的发酵培养  22-23
        2．1．3．1 种子液的制备  22-23
        2．1．3．2 摇瓶发酵条件优化培养  23
    2．2 纤溶酶活性的测定  23-25
      2．2．1 猪血浆平板的制备  23
      2．2．2 纤维蛋白平板的制备  23-24
      2．2．3 纤溶酶的测活  24
      2．2．4 尿激酶标准曲线的制备  24-25
    2．3 纤溶酶的分离纯化  25-26
      2．3．1 粗分级分离  25
      2．3．2 柱层析  25-26
    2．4 SDS-PAGE电泳检测  26-28
      2．4．1 SDS-PAGE电泳  26-27
      2．4．2 考马斯亮蓝染色  27-28
三、 结果与分析  28-44
  1． 菌种的形态特征与生长特征  28
    1．1 菌种的形态特征  28
  2． 液体发酵的优化条件  28-39
    2．1 培养基成分的优化  28-35
      2．1．1 氮源对产酶的影响  28-30
      2．1．2 碳源对产酶的影响  30-31
      2．1．3 碳氮比对产酶的影响  31-32
      2．1．4 氮源浓度的优化  32
      2．1．5 碳源浓度的优化  32-33
      2．1．6 离子组成对产酶的影响  33-34
      2．1．7 表面活性剂对产酶的影响  34-35
    2．2 温度的优化  35-36
    2．3 pH的优化  36-37
    2．4 装液量及转速的优化  37-38
    2．5 接种量的优化  38-39
    2．6 种龄的优化  39
  3． 尿激酶标准曲线  39-40
  4． 纤溶酶的纯化  40-41
  5． SDS-PAGE电泳  41
  6． 纤溶活性成分BH-1的性质研究  41-44
    6．1 执稳定性  41-42
    6．2 pH对BH-1活性的影响  42
    6．3 体外纤溶性质  42-44
四、 讨论  44-47
  1． 纤溶酶液体发酵的优化条件  44-45
  2． 纤溶酶的测活方法  45-46
  3． 纤溶酶BH-1与胞外酶  46
  4． 纯化产物BH-1与纳豆激酶  46-47
五、 结论  47-48
附录 1  48-49
附录 2  49-52
附录 3  52-53
参考文献  53-58
英文摘要  58-59
致谢  59

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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