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鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白酵母表达条件的优化及生物活性研究

作　者: 王学强
导　师: 程相朝
学　校: 河南科技大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 鸡IL-18-HN 酵母表达优化活性检测免疫效果检测
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)是近年发现的一种细胞因子,具有诱生IFN-γ、促进T细胞增殖分化等生物学功能,在宿主防御、抗变态反应、抑瘤抗瘤等方面具有重要作用。同时IL-18作为天然的免疫调节剂和疫苗佐剂克服了使用传统药物成本高,副作用大等缺点,是一种可以替代传统疗法的新型免疫调节剂,具有很大的应用前景。目前国内外对IL-18的研究主要集中在人和鼠等哺乳动物,而对鸡IL-18的研究,特别是增强免疫方面的报道较少。故此,本研究在对酵母表达系统中表达的鸡IL-18与新城疫病毒HN基因融合蛋白进行表达条件优化、纯化的基础上,分别对不同形式IL-18和HN联合免疫雏鸡的免疫应答情况进行了比较检测,为进一步研究鸡IL-18的生物学功能及其在疫苗中的应用奠定基础。本研究对已构建好的携带有IL-18与HN融合基因的重组酵母菌遗传稳定性进行了分析,筛选优化了其最佳表达条件,实现了融合基因在酵母中高效表达;表达蛋白经纯化、定量后分别用Western bloting、MTT等方法在体外对其生物学活性进行分析。结果表明,该重组工程菌能稳定地表达鸡IL-18-HN融合蛋白。其在培养液pH6.5、甲醇诱导浓度1.5%、诱导温度30℃的条件下诱导156h,目的蛋白的表达量最高,为400mg/L。纯化后的体外活性检测试验表明,其表达的鸡IL-18-HN融合蛋白具有明显的刺激淋巴细胞增殖的活性。同时将含有鸡IL-18-HN融合基因的重组质粒PSK-HN-IL18,应用KpnⅠ和NotⅠ双酶切,切出HN-IL18融合基因,回收并连接经相同酶切的真核表达载体pcDNA3,成功构建了含有HN和IL-18融合蛋白基因的pcDNA3-HN-IL18真核表达载体。在上述工作基础上,对鸡IL-18-HN融合蛋白免疫效果通过实验鸡进行了检测。试验共分6组,即融合蛋白组、HN蛋白组、真核表达的ChIL-18组、HN蛋白+真核表达的ChIL-18组、pcDNA3-HN-IL18组和空白对照组,每组50只,正常饲养程序饲养至8日龄时各组进行免疫接种,试验组在用颈部皮下注射方式分别进行不同类型的新城疫免疫,每只剂量50μg,空白对照组注射相同剂量的生理盐水,pcDNA3-HN-IL18组每只剂量20μg,12日龄用同样方式进行二免,分别于免疫后的第4d,7d,14d,21d,28d对其血清的抗体效价、外周血的T淋巴细胞转化水平及其NO分泌、免疫器官指数及免疫器官T淋巴细胞数和免疫器官IgG抗体生成细胞进行测定,并在26日龄时每组取20只用于动物攻毒保护试验。结果表明:IL-18和HN蛋白联合使用可以明显增强新城疫的免疫效果。与单独的HN组相比,联合免疫组试验雏鸡血清中抗体水平、T淋巴细胞转化水平和巨噬细胞分泌NO的能力显著提高,较好促进了免疫器官的生长发育和成熟,免疫器官T淋巴细胞数量和IgG抗体生成细胞数量明显增多,融合蛋白的使用进一步强化了这种作用。

全文目录

摘要  11-13
ABSTRACT  13-19
第1章文献综述  19-33
  1.1 IL-18 的分子生物学研究进展  19-24
    1.1.1 IL-18 的来源  19
    1.1.2 IL-18 的分子结构  19-20
    1.1.3 IL-18 的生物学活性  20-22
    1.1.4 IL-18 的受体及信号传递  22
    1.1.5 ChIL-18 的应用前景  22-24
  1.2 HN 基因在新城疫疫苗中的应用研究  24-29
    1.2.1 新城疫HN 基因的分子结构  24-25
    1.2.2 新城疫HN 基因的分子生物学特性  25-26
    1.2.3 新城疫HN 基因在疫苗中的应用  26-29
  1.3 毕赤酵母表达系统的特点及研究前景  29-32
    1.3.1 不同诱导时间对重组菌表达目的蛋白的影响  29
    1.3.2 不同pH 值的培养液对重组菌表达目的蛋白的影响  29
    1.3.3 不同诱导剂剂量即甲醇浓度对重组菌表达目的蛋白的影响  29-30
    1.3.4 不同诱导温度对重组菌表达目的蛋白的影响  30-31
    1.3.5 毕赤酵母表达系统的优势  31-32
  1.4 研究目的及意义  32-33
第2章鸡 IL-18 与新城疫 HN 基因融合蛋白的表达条件优化、纯化与体外活性检测  33-52
  2.1 材料  33-37
    2.1.1 载体、菌株及抗体  33
    2.1.2 主要酶和试剂  33-34
    2.1.3 主要仪器  34
    2.1.4 主要试剂的配置  34-37
  2.2 方法  37-42
    2.2.1 重组酵母菌的诱导表达及SDS-PAGE  37-38
    2.2.2 表达产物的Western blotting 分析  38-39
    2.2.3 CHMIL-18-HN 的重组表达载体在酵母中的遗传稳定性试验  39
    2.2.4 重组菌表达条件的优化  39-40
    2.2.5 酵母表达ChMIL-18-HN 蛋白的纯化和定量  40-41
    2.2.6 Bradford 法测定蛋白质含量  41
    2.2.7 ChIL-18-HN 蛋白促进鸡外周血淋巴细胞转化试验  41-42
  2.3 试验结果与分析  42-48
    2.3.1 融合菌进行诱导表达及Western blot 分析  42-43
    2.3.2 CHMIL-18-HN 重组表达载体在酵母中的遗传稳定性试验  43
    2.3.3 不同诱导时间下ChMIL18-HN 融合蛋白的表达情况  43-44
    2.3.4 ChMIL18-HN 在不同pH 值的培养液中诱导表达的情况  44-45
    2.3.5 ChMIL18-HN 在不同诱导剂剂量即甲醇浓度条件下表达的情况  45-46
    2.3.6 温度对ChMIL18-HN 表达量的影响  46
    2.3.7 重组菌在优化条件下表达目的蛋白的情况  46-47
    2.3.8 蛋白含量的测定  47-48
    2.3.9 鸡淋巴细胞转化试验结果  48
  2.4 讨论  48-52
第3章 pcDNA3 与 HN-IL18 融合基因真核载体的构建  52-58
  3.1 材料  52-54
    3.1.1 质粒和菌株  52-53
    3.1.2 主要酶和试剂  53
    3.1.3 主要仪器  53
    3.1.4 主要试剂配置  53-54
  3.2 方法  54-56
    3.2.1 重组质粒PSK-HN-IL18 大量提取及纯化  54
    3.2.2 质粒pcDNA3 和PSK-HN-IL18 的Kpn I 和Not I 双酶切及酶切产物的纯化  54
    3.2.3 连接反应  54-55
    3.2.4 连接产物原核宿主菌JM109 感受态细胞的转化  55
    3.2.5 重组质粒的鉴定  55-56
  3.3 结果  56-57
    3.3.1 重组质粒pcDNA3-HN-IL18 的构建及鉴定  56-57
    3.3.2 重组质粒pcDNA3-HN-IL18 大量提取  57
  3.4 讨论  57-58
第4章重组鸡 IL-18 与新城疫 HN 基因融合蛋白的免疫效果研究  58-83
  4.1  58-60
    4.1.1 疫苗和毒株  58
    4.1.2 实验动物  58-59
    4.1.3 主要试剂  59
    4.1.4 主要仪器与设备  59-60
    4.1.5 主要试剂配制  60
  4.2 方法  60-65
    4.2.1 0.5%鸡红细胞悬液的制备  60
    4.2.2 抗原效价的检测  60-61
    4.2.3 血清抗体效价的检测  61
    4.2.4 试验鸡的分组及免疫  61-62
    4.2.5 血清中抗体效价的测定  62
    4.2.6 外周血T 淋巴细胞转化试验  62
    4.2.7 巨噬细胞分泌NO 的测定  62-63
    4.2.8 试验组的生长增重情况及免疫器官生长发育情况的测定  63
    4.2.9 非特异性酯酶染色法检测鸡的T 淋巴细胞变化  63-64
    4.2.10 免疫器官IgG 生成细胞数量测定-石蜡组织切片及免疫酶组织化学法  64-65
    4.2.11 攻毒试验  65
    4.2.12 数据分析  65
  4.3 结果与分析  65-80
    4.3.1 血清中抗体效价的测定结果  65-67
    4.3.2 外周血T 淋巴细胞转化试验  67-68
    4.3.3 巨噬细胞分泌NO 的测定  68-69
    4.3.4 试验鸡免疫器官指数的测定  69-72
    4.3.5 试验鸡免疫器官中T 淋巴细胞数量变化测定  72-76
    4.3.6 试验鸡免疫器官中IgG 抗体生成细胞数量变化测定  76-79
    4.3.7 攻毒试验  79-80
  4.4 讨论  80-83
第5章结论  83-85
参考文献  85-93
附录病例解剖图和组织切片图  93-95
致谢  95-97
攻读硕士学位期间的研究成果  97

鸡IL-18与新城疫HN基因融合蛋白酵母表达条件的优化及生物活性研究

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