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奶牛GM-CSF的克隆、表达、活性检测与乳房炎治疗试验

作　者: 傅军科
导　师: 孙延鸣
学　校: 石河子大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 奶牛 GM-CSF 克隆表达活性检测乳房炎
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

奶牛乳房炎是奶牛乳腺发生的一种炎症,是一种复杂的、导致奶牛业经济损失最严重的疾病。尽管西方一些国家对此病已进行了100多年研究,但至今未能提出一个彻底解决的办法。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生,能够诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体呈集落性生长(即形成集落)。GM-CSF主要作用是对粒细胞系和单核细胞系的维持存活,促进生长、诱导分化和增强功能等。本研究就是想利用GM-CSF的这一功能,结合抗菌药与中药对奶牛乳房炎治疗的新方法进行初步研究,国内在该领域的研究尚未见报道,为此我们主要进行了以下工作:1.奶牛GM-CSF的克隆、表达根据Genebank(U22385)公布的牛GM-CSF基因序列。设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术,从LPS诱导的奶牛肺泡巨噬细胞中,扩增得到奶牛GM-CSF基因,基因全长cDS为432bp。成功克隆到表达载体质粒pET-32a上,将此重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导进行蛋白表达,分子量大小为35KDa左右。2. rboGM-CSF的纯化在成功构建pET-32a-GM-CSF表达载体的基础上,采用调整IPTG浓度与诱导温度的方法来优化诱导表达条件,SDS-PAGE分析发现重组蛋白大部分以包涵体形式存在。而后分别通过尿素变、复性包涵体的方法和Ni-NTA纯化可溶性奶牛GM-CSF的方法纯化重组蛋白。结果表明,应用尿素溶解包涵体,然后在含有递减浓度尿素的缓冲液中分步透析复性,重组蛋白获得率较高;采用Ni-NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度更高。3. rboGM-CSF的生物学活性检测采用了软琼脂集落刺激法和MTT比色分析法,对重组蛋白进行了生物学活性检测。结果表明,经MTT比色分析,复性包涵体和Ni-NTA纯化蛋白均有明显的维持奶牛活化淋巴细胞生长和增殖能力,Ni-NTA纯化蛋白在92μg/ml的浓度下促进淋巴细胞增殖能力最强,还发现并不是rboGM-CSF浓度越高对维持活化淋巴细胞生长和增殖作用越强;rboGM-CSF能够刺激奶牛活化淋巴细胞在软琼脂中形成集落,进一步说明纯化蛋白具有良好的生物学活性。4. rboGM-CSF结合抗生素治疗奶牛隐性乳房炎试验先后选择新西兰奶牛48头,按体细胞数分为两组,验证rboGM-CSF单独使用以及与抗菌药联合使用后,对不同体细胞数的奶牛隐性乳房炎的治疗效果。结果表明,单独使用rboGM-CSF对体细胞数在100万个/ml以下的隐性乳房炎奶牛具有50℅的治愈率,而对100万个/ml以上的却没有明显疗效;单独使用庆大霉素对二者的治愈率分别为33℅和16.6℅;与庆大霉素合用后发现对二者的治愈率分别为83.3℅和50℅,说明rboGM-CSF与庆大霉素具有协同作用;注射rboGM-CSF后除了短暂的体温升高,对奶牛没有任何副作用。5. rboGM-CSF结合中药治疗奶牛亚急性临床型乳房炎选择亚急性临床型奶牛新西兰奶牛16头,乳内灌注rboGM-CSF的同时灌服中药(乳炎宝)。将rboGM-CSF与中药合用,旨在寻求一种新的治疗方法。结果表明,二者联合使用后所有奶牛临床症状消失,治愈率达到了87.5℅,有效率为100℅。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
主要符号表  11-13
绪论  13-14
第一部分文献综述  14-24
  一 GM-CSF 研究动态  14-16
    1. GM-CSF 的概念和分类  14
    2. GM-CSF 的产生和调节  14-15
    3. GM-CSF 的生物学功能  15
    4. GM-CSF 的应用  15-16
  二奶牛乳房炎概况  16-20
    1 奶牛乳房炎的发病类型与症状  16
    2 乳房炎的诊断方法  16-17
    3 奶牛乳房炎发病主要原因  17-18
    4 奶牛乳房炎的防治研究现状  18-20
  三细胞因子方法治疗乳房炎的研究动态  20-22
    1 细胞因子在兽医临床上的研究与应用  20-21
    2 细胞因子在治疗奶牛乳房炎中的研究与应用  21-22
  四存在的问题  22
  五本试验研究意义  22-24
第二部分试验部分  24-59
  试验一奶牛GM-CSF 的克隆、表达  24-40
    1. 材料与方法  24-32
      1.1 细胞及载体  24
      1.2 菌株及主要试剂  24
      1.3 主要仪器设备  24
      1.4 引物设计与合成  24-25
      1.5 脂多糖诱导绵羊肺泡巨噬细胞试验  25
      1.6 RNA 的提取与反转录PCR  25-26
      1.7 基因克隆与鉴定  26-28
      1.8 奶牛GM-CSF 表达载体的构建  28-32
    2. 结果及分析  32-38
      2.1 提取总RNA 进行RT-PCR  32
      2.2 含pGEM–T-GM-CSF 载体质粒的克隆菌PCR 鉴定  32-33
      2.3 pGEM–T-GM-CSF 载体质粒双酶切鉴定  33
      2.4 基因序列测定  33-34
      2.5 基因序列及氨基酸序列的比较并绘制进化树  34-35
      2.6 含pET32a-GM-CSF 表达载体质粒的克隆菌PCR 鉴定  35
      2.7 pET32a-GM-CSF 表达载体质粒的双酶切鉴定  35-36
      2.8 奶牛GM-CSF 基因表达结果  36-37
      2.9 奶牛GM-CSF 蛋白二级结构与3D 模型构建  37-38
    3. 讨论  38-40
  试验二 rboGM-CSF 的变、复性研究与纯化  40-44
    1. 材料与方法  40-42
      1.1 菌株  40
      1.2 主要仪器  40
      1.3 试剂  40
      1.4 菌体的诱导与收集  40
      1.5 菌体的裂解及利用Ni-NTA 蛋白纯化柱纯化蛋白  40-41
      1.6 利用包涵体的变性与复性纯化蛋白  41
      1.7 SDS-PAGE  41-42
    2. 结果  42
    3. 讨论  42-44
  试验三 rboGM-CSF 的生物学活性检测  44-50
    1. 材料与方法  44-45
      1.1 细胞  44
      1.2 主要试剂  44
      1.3 主要仪器  44
      1.4 MTT 法检测rboGM-CSF 活性  44-45
      1.5 集落形成试验检测rboGM-CSF 活性  45
    2. 结果  45-49
      2.1 淋巴细胞分离结果  45-46
      2.2 MTT 法检测重组蛋白对淋巴细胞增殖效果  46-47
      2.3 集落形成试验检测重组生物学蛋白活性  47-49
    3. 讨论  49-50
  试验四 rboGM-CSF 结合抗生素治疗奶牛隐性乳房炎试验  50-56
    1. 材料与方法  50-51
      1.1 试验材料与主要仪器  50
      1.2 环境条件  50
      1.3 试验牛的管理与选择  50
      1.4 试验方案  50-51
      1.5 牛奶SCC 计数  51
    2 结果与分析  51-54
      2.1 体温与日产奶量  51-53
      2.2 SCC 计数  53-54
    3. 讨论  54-56
  试验五 rboGM-CSF 结合中药治疗奶牛亚急性临床型乳房炎  56-59
    1. 材料与方法  56-57
      1.1 试验牛的管理  56
      1.2 环境条件  56
      1.3 试验材料与主要仪器  56
      1.4 试验方案  56-57
    2. 结果与分析  57-58
      2.1 体温变化情况  57
      2.2 SCC 计数  57-58
    3. 讨论  58-59
论文结论  59-60
创新点  60-62
参考文献  62-68
附录一相关试剂配制  68-71
致谢  71-72
石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表  72-73
个人简历及发表论文  73

奶牛GM-CSF的克隆、表达、活性检测与乳房炎治疗试验

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