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家蝇抗菌肽Cec Md在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其活性的研究

作　者: 赵平森
导　师: 姜宁
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 家蝇抗菌肽Cec Md 大肠杆菌高效表达蛋白纯化表达优化活性检测
分类号: S816
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

抗生素在畜牧业中的广泛应用甚至滥用,降低了动物性产品的品质,威胁到了消费者的健康利益。这不仅危害了我国的公共卫生安全,破坏畜牧产业链的正常运转,而且在很大程度上削弱了我国动物性产品在国际市场上的竞争力。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)为一类阳离子小肽,是生物体固有免疫系统的重要组成成分,具有广谱杭菌活性。AMPs以其独特的生物活性和作用机理,已经成为当前生物学、医药学和农学领域的研究热点。AMPs具有无致病菌耐药性、无残留、耐高温以及具有靶细胞高度特异性等优点,将成为传统抗生素在饲料工业领域理想的替代品。故深化抗菌肽的基础性研究及其系列产品的开发对提升畜禽产品质量、提高畜禽生产性能和疫病抵抗能力乃至推动整个畜牧业的发展具有重要意义。本研究主要开展了如下几个方面的探索:(1)Cec Md基因的克隆与生物信息学分析。利用脂多糖(LPS)诱导或非诱导的家蝇幼虫体内抽提总RNA,根据家蝇cecropin基因(GenBank:DQ 232774)设计特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出编码Cec Md开放阅读框(ORF)的cDNA序列,将其克隆入pMD18-T载体,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,对此基因及其氨基酸推导序列进行系统的生物信息学分析。结果表明从LPS诱导的家蝇幼虫体内成功的扩增出家蝇抗菌肽cecropin基因,但从未诱导的虫体内未能获得此基因;克隆的家蝇Cec Md基因大小为192 bp,编码由63氨基酸残基组成的多肽,分子量6739.94,其中强碱性氨基酸8个、强酸性氨基酸4个、疏水性氨基酸30个、极性氨基酸14个;Cec Md最可能的裂解位点在A23和G24之间,提示N端1～23氨基酸为Cec Md的信号肽,C端24～63氨基酸构成成熟肽;3-D结构预测结果表明,Cec Md的成熟肽含有2个螺旋结构,不含二硫键;Cec Md与果蝇cecropins的同源性显著高于其他昆虫,达到81.0%以上,最高者为84.1%。(2)Cec Md基因在E.coli中的表达与产物纯化。将构建好的pMD18-T/Cec Md经双酶切后,获取线性目的基因片段,将其定向重组于表达载体pET32a(+)和pGEX-6P-1,进行PCR、双酶切鉴定和DNA测序分析。确定成功构建重组表达载体pET32a(+)/Cec Md和pGEX-6P-1/Cec Md后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达。结果表明,在SDS-PAGE胶片中未检测出pET32a(+)/Cec Md重组载体的蛋白表达条带;经SDS-PAGE和Western blot检测,证明pGEX-6P-1/Cec Md在BL21(DE3)获得大量表达,成功建立pGEX-6P-1/Cec Md/BL21(DE3)重组基因工程菌株;重组蛋白以包涵体形式存在,后者用High-Affinity GST Resin亲和层析柱进行纯化,然后用PreScissionTM Protease对融合蛋白进行切割,获得纯化的Cec Md蛋白;测定得出本蛋白样品Cec Md融合蛋白的含为336.83mg/mL,Cec Md在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的得率为650mg/L培养液。(3)重组工程菌表达条件的优化。对重组基因工程菌pGEX-6p-1/Cec Md/BL21(DE3)在不同培养基中的生长曲线进行了测定。结果表明:TB培养基最适合重组基因工程菌的生长;IPTG诱导后,菌体生长曲线发生改变,使抗菌肽重组菌的生长密度低于对照组(非重组基因工程菌)。发现抗菌肽的表达可降低宿主菌的生长密度,此效应也从侧面反应了Cec Md融合蛋白的抑菌活性;通过对Cec Md融合蛋白最佳表达条件的初步摸索,确定最佳的发酵条件为:①培养基:TB培养基;②IPTG浓度: 0.8mmol/L;③诱导时间: 6h;④温度:37℃。最终确定了pGEX-6p-1/Cec Md/BL21(DE3)菌株的高效表达条件,进而获得了高表达的Cec Md,为其在生物反应器中的高密度培养提供了实验依据。(4)家蝇抗菌肽Cec Md活性的研究。结果显示,Cec Md和Cec Md融合蛋白(未经PreScissionTM Protease切割的Cec Md融合蛋白)均抑制大肠杆菌、沙门菌和停乳链球菌的生长,二者抑菌圈大小相仿,与氨苄青霉素的抑菌活性接近;Cec Md对大肠杆菌、沙门菌和停乳链球菌三菌株的最小抑菌浓度(MIC)均低于氨苄青霉素组,Cec Md对大肠杆菌和鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度是氨苄青霉素组的50%,Cec Md在浓度为5.86μmol/L时,就对停乳链球菌的生长产生抑制作用,但氨苄青霉素只有浓度>750μmol/L时才出现抑菌活性。热稳定性检测说明Cec Md的热稳定性较好,高温20min不能破坏Cec Md的结构和抑菌活性。通过探索Cec Md对SD大鼠和三黄鸡的外周血淋巴细胞转化率的影响,发现Cec Md能显著提高实验动物的外周血淋巴细胞转化率,说明Cec Md对机体的细胞免疫功能有积极的促进作用。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章文献综述  11-26
  1.1 抗菌肽研究进展  11-24
  1.2 本研究的思路与内容  24-25
  1.3 本研究的目的和意义  25-26
第二章家蝇抗菌肽Cec Md 基因的克隆及生物信息学分析  26-41
  2.1 引言  26-27
  2.2 材料  27-30
  2.3 方法  30-36
  2.4 结果  36-40
  2.5 讨论  40
  2.6 结论  40-41
第三章家蝇抗菌肽Cec Md 在E.Coli 中的表达及纯化  41-62
  3.1 引言  41
  3.2 材料  41-47
  3.3 方法  47-53
  3.4 结果  53-59
  3.5 讨论  59-60
  3.6 结论  60-62
第四章重组基因工程菌发酵条件的优化  62-72
  4.1 引言  62
  4.2 材料  62-64
  4.3 方法  64-65
  4.4 结果  65-70
  4.5 讨论  70-71
  4.6 结论  71-72
第五章家蝇抗菌肽Cec Md 活性的研究  72-81
  5.1 引言  72-73
  5.2 材料  73-74
  5.3 方法  74-76
  5.4 结果  76-79
  5.5 讨论  79-80
  5.6 结论  80-81
第六章总体结论与工作展望  81-82
  6.1 总体结论  81
  6.2 本研究创新点  81
  6.3 需要进一步研究的工作  81-82
参考文献  82-88
致谢  88-89
附录  89-95
作者简历  95

家蝇抗菌肽Cec Md在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其活性的研究

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