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肉牛早孕因子（EPF）的活性检测及分离纯化

作　者: 贺加双
导　师: 马卫明
学　校: 山东农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 孕牛血清 早孕因子 活性检测 分离纯化
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 31次
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内容摘要


早孕因子(Early Pregnancy Factor,EPF)是存在于妊娠早期母体血清中的一种具有免疫抑制及生长调节作用的蛋白质。1974年由澳大利亚学者Morton等在孕鼠血清中首次发现,由于在小鼠交配6 h后就可检测到,因此被命名为早孕因子。早孕因子是哺乳动物受精后最早在血液中出现的具有妊娠相关免疫抑制活性的多肽物质。普遍认为它是热激蛋白家族成员伴侣蛋白10的同系物。可用E玫瑰花环抑制试验(E Rosette Inhibition Test,E-RIT)做生物学鉴定。妊娠早期分泌的EPF能阻止母体的免疫系统将胎儿识别为外源物质,及对胎儿产生应答。早孕因子的产生依赖于一个合适的激素环境,与卵巢、输卵管、受精卵、胎盘、垂体等有关。早孕因子在动物受精数小时后即可在母体血液中被检测出来,在整个孕期持续存在。在母体分娩以后EPF随即消失。EPF可以用于早期妊娠诊断,预测早期胚胎死亡与流产、鉴定胚胎移植效果、监测胎儿的状态等,其次,EPF作为一种温和的、天然的免疫抑制物,在治疗自身免疫性疾病、预防器官移植后排斥反应等领域有研究价值。因此研究这种蛋白质对牛业生产具有重要意义。本实验采集授精后20 h,25 h与30 h后的肉牛血清和阴道粘液,尝试建立简单有效的E玫瑰花环抑制实验,以快速准确地检测早孕因子活性,并测定血液及阴道粘液中早孕因子的最早可检测时间,以确定进行早期妊娠检测的最早时机和最佳方法。采集妊娠1～9个月健康孕牛血清,通过DEAE-52离子交换层析,Con A-Sepharose 4B亲和层析和Heparin Sepharose Cl 6B亲和层析分离纯化技术,从孕牛血清中分离出纯化的EPF。用E玫瑰花环抑制实验对各阶段产物EPF活性进行检测。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳对纯化的EPF等电点进行分析。结果表明,授精后的肉牛在20h之间能够检测出早孕因子活性,阴道粘液的可检测时间是25h,怀孕牛和未怀孕牛血清的E玫瑰花环抑制滴度差异显著(P < 0.05),纯化出的EPF通过E玫瑰花环抑制实验显示具有活性,其分子质量为53.6 ku,等电点为6.8。结论是通过E玫瑰花环抑制实验检测早孕因子活性可以鉴定肉牛的妊娠状态,且最早可以在授精20h之内在血液中检测出,纯化出的EPF通过E玫瑰花环抑制实验具有活性,经SDS-PAGE出现分子量为53.6Ku一条蛋白质区带。经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法检测EPF的等电点为6.8。

全文目录


符号说明  4-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
前言  12-29
  1.1 早孕因子的本质与特性  13-15
  1.2 早孕因子的来源  15-16
  1.3 早孕因子的存在形式及存在位置  16-17
  1.4 早孕因子的生物学作用  17-19
    1.4.1 免疫抑制调节作用  17-19
    1.4.2 生长调节中的作用  19
  1.5 早孕因子的作用机理  19-22
    1.5.1 早孕因子的免疫抑制作用  20-21
    1.5.2 早孕因子的生长调节作用  21-22
  1.6 早孕因子的应用  22-26
    1.6.1 超早孕检测  22-23
    1.6.2 胚胎监控  23-24
    1.6.3 肿瘤细胞的早期诊断  24-25
    1.6.4 免疫相关疾病方面的应用  25-26
  1.7 早孕因子分离纯化  26-28
    1.7.1 纯化方法一  27
    1.7.2 纯化方法二  27-28
  1.8 早孕因子活性的检测  28-29
2. 材料与方法  29-34
  2.1 实验主要仪器与材料  29-31
    2.1.1 主要仪器  29
    2.1.2 主要试剂及配制  29-31
  2.2 实验方法  31-34
    2.2.1 血样的采集与处理  31-32
    2.2.2 牛外周血淋巴细胞悬液的制备  32
    2.2.3 绵羊红细胞（SRBC）的制备  32
    2.2.4 玫瑰花环形成率检测  32-33
    2.2.5 早孕因子活性在孕牛体内最早可检测时间的测定  33
    2.2.6 EPF 的分离与纯化  33-34
    2.2.7 EPF 分离纯化结果的检测  34
    2.2.8 EPF 等电点的测定  34
    2.2.9 数据分析  34
3 结果与分析  34-41
  3.1 肉牛血清中 EPF 活性的检测  34-35
  3.2 早孕因子活性在孕牛体内最早可检测时间的测定  35-37
    3.2.1 授精后不同时间肉牛血液中的早孕因子活性  35
    3.2.2 肉牛授精后不同时间阴道粘液中的早孕因子活性  35-37
  3.3 玫瑰花环形成情况  37-38
    3.3.1 对照组  37
    3.3.2 怀孕牛组  37-38
  3.4 孕牛血清中EPF 的分离与纯化  38-40
    3.4.1 DEAE-52 离子交换层析  38
    3.4.2 ConA Sepharose 4B 亲和层析  38-39
    3.4.3 Heparin Sepharose CL 6B 亲和层析  39-40
  3.5 EPF 分离纯化结果的检测  40-41
  3.6 EPF 等电点的测定  41
4 分析  41-45
5 结论  45-47
参考文献  47-56
附录  56-57
致谢  57-58
硕士期间论文发表情况  58-59
硕士学位论文内容简介及自评  59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
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