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人脂联素的原核表达及生物活性检测

作　者: 史晓文
导　师: 刘德敏
学　校: 天津医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 脂联素 糖尿病 原核表达 蛋白纯化 蛋白复性 生物活性检测 重组蛋白
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


近年来的研究发现脂肪组织除能量储存外,尚具有活跃的内分泌功能。在代谢状态改变或接受外界刺激时,脂肪组织可分泌多种具有生理活性的蛋白质,即脂肪细胞因子,包括瘦素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、抵抗素、白细胞介素6（IL-6）、脂联素（adiponectin,ADPN）等。这些激素参与了神经、内分泌与免疫网络的调节,尤其对能量代谢调节具有重要的作用。脂联素作为一种脂肪细胞因子,具有重要的生理功能:改善糖脂代谢及胰岛素抵抗;通过抑制人类主动脉内皮细胞（HAECs）表面的血管细胞粘附分子及细胞间粘附分子等的表达,起到抗动脉粥样硬化的作用;可使肥胖者个体质量减轻;通过抑制巨噬细胞前体细胞的生成和成熟巨噬细胞的功能调节炎症反应。因此,脂联素与胰岛素抵抗、2型糖尿病、肥胖以及心血管疾病等具有密切联系。近年来的研究还表明,脂联素可直接或间接影响肿瘤的发生发展。在对脂联素多年的研究中发现,低脂联素水平不仅与胰岛素抵抗及2型糖尿病相关,低脂联素血症还可出现在心血管疾病、高血压、血脂异常中。血清脂联素水平的检测可以作为代谢性疾病诊断及治疗评价的指标,而补充重组脂联素或增加内源性脂联素的分泌则为胰岛素抵抗相关疾病的预防和治疗提供了一种新的思路与手段。目前,国内外已有一些研究应用多种蛋白表达系统构建重组脂联素,包括原核及真核表达系统。其中原核表达体系因其成本低,操作简便以及产量高等众多优点而被广泛应用。本研究所采用的表达载体pQE-30Xa是Qiagen公司提供的一种高效表达和纯化外源蛋白的原核表达系统,相对于其他载体具有很多优势,目前国内尚未见使用该载体获得脂联素蛋白的相关报道。研究目的:1.克隆人脂联素目的基因,构建pQE-30Xa/ADPN原核表达载体。2.转化入大肠杆菌E.coli M15[pREP4]进行重组蛋白的表达,鉴定表达产物。3.优化表达条件,以期建立高效表达的技术流程。实验方法:1.从人的脂肪组织中提取总RNA,利用RT-PCR的方法得到人脂联素基因cDNA序列,构建模板质粒;自行设计引物一对,经PCR扩增人脂联素基因完全编码序列并使两端加上双酶切位点,构建pMD18-T/ADPN重组克隆质粒;pMD18-T/ADPN与pQE-30Xa质粒经限制性核酸内切酶BamHI与HindIII双酶切后,用T4DNA连接酶进行连接,构建重组表达载体pQE-30Xa/ADPN。2.将重组质粒转化入M15[pREP4]表达菌株中,IPTG诱导表达;提取包涵体,SDS-PAGE及Western blot鉴定表达产物;从诱导时间、温度及诱导剂浓度三方面摸索最适表达条件。3.按照优化条件进行蛋白质的大量表达;在变性条件下利用His Band Kit纯化目的蛋白;PAPIB法梯度透析复性,SDS-PAGE鉴定蛋白纯度;Bradford法进行蛋白定量分析;MTS细胞增殖实验检测获得目的蛋白的生物学活性。实验结果:1.成功构建重组表达载体pQE-30Xa/ADPN,经测序证实插入的目的片段无误。2.脂联素目的蛋白在E.coli.M15菌株中获得了表达,其中诱导剂IPTG终浓度为0.6mM、温度为37℃、诱导表达6小时后所获得的蛋白含量相对较高。3.经His Band Kit纯化后,可获得单一的脂联素目的蛋白条带,蛋白纯化效果较好;蛋白表达效率约为24.8%,产量约为330μg/100ml LB培基;经MTS实验证实获得的重组蛋白具有生物活性。实验结论:成功构建了人脂联素原核表达载体pQE-30Xa/ADPN,并在E.coli.M15菌株中获得了表达,且获得的重组蛋白具有生物学活性。pQE-30Xa原核表达系统是一个高效、快速构建重组脂联素蛋白的良好选择。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
符号说明  9-10
前言  10-13
  研究现状、成果  10-11
  研究目的、方法  11-13
一、 人脂联素原核表达载体pQE-30Xa/ADPN的构建  13-28
  1.1 对象和方法  13-20
  1.2 结果  20-21
  1.3 讨论  21-27
  1.4 小结  27-28
二、 重组脂联素的表达及条件的优化  28-37
  2.1 材料和方法  28-32
  2.2 结果  32-35
  2.3 讨论  35-36
  2.4 小结  36-37
三、 重组蛋白的纯化、复性及生物活性检测  37-48
  3.1 对象和方法  37-42
  3.2 结果  42-45
  3.3 讨论  45-47
  3.4 小结  47-48
结论  48-49
参考文献  49-54
发表论文和参加科研情况说明  54-55
附录  55-60
综述  60-66
  视黄醇结合蛋白4与2型糖尿病  60-63
  综述参考文献  63-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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