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高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白H5的融合蛋白在哺乳动物细胞中的高量表达纯化及活性检测

作　者: 杨璟琳
导　师: 蒋澄宇
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: H5N1 哺乳动物细胞 融合蛋白 活性检测 表达纯化 表达及纯化 质粒 血凝素 高致病性禽流感 酵母表达 北京协和医学院 基因免疫 甲型流感病毒 感受态细胞 原核细胞表达 转染细胞 禽流感病毒 中国医学科学院 病毒基因组 密码子的使用
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


禽流感是由甲型流感病毒引起的一种禽鸟传染病。甲型流感病毒的16个主要亚型中,只有H5和H7亚型中的毒株可引起高致病性禽流感,在易感禽类物种中具有高度接触传染性,并迅速造成死亡。自1959年以来,H5、H7和H9亚型病毒已10次跨越物种障碍感染人类。H5N1已在1997年、2003年的持续暴发中造成严重疾病及高病死率。2003年至2008年4月17日,WHO报道经实验室确证的H5N1禽流感感染者共381例,死亡240例,死亡率超过60%。血凝素蛋白5(hemagglutinin 5, H5蛋白)是病毒H5N1表面的膜蛋白,与受体结合并促进病毒入胞,能诱发机体免疫系统产生中和抗体的主要抗原蛋白。但由于H5蛋白存在大量的翻译后修饰位点,主要是糖基化位点,致使通过原核细胞表达或酵母表达的蛋白将不能正确地修饰,折叠和加工处理,从而保持蛋白的活性。只有在哺乳动物细胞系统中进行表达,H5蛋白才能进行正确地修饰,折叠和加工处理,从而保持蛋白的活性。但在哺乳动物细胞系统中表达的H5蛋白又存在表达量低的特点,难以在实际中应用。因此,本论文通过一系列的优化与实验,将全长的H5蛋白及其去掉跨膜端的H5分泌蛋白在哺乳动物细胞系统中进行了高量表达及纯化。本论文通过实现H5蛋白在哺乳动物细胞系统中高量表达及纯化,使H5蛋白的大规模生产成为可能,从而为H5N1基因工程重组疫苗的规模化生产和应用提供可能。

全文目录


目录  3-6
图表目录  6-7
中文摘要  7-8
Abstract  8-9
英文略语表  9-11
前言  11-13
第一部分 H5N1血凝素蛋白H5基因的质粒构建  13-30
  1 实验材料  13-17
    1.1 质粒  13
    1.2 菌株  13
    1.3 工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker  13
    1.4 主要化学试剂  13-14
    1.5 试剂盒  14
    1.6 主要仪器及设备  14-15
    1.7 主要溶液配方  15-17
      1.7.1 E.coli用培养基的配制  15
      1.7.2 制备感受态细胞相关溶液  15
      1.7.3 抗生素的配制  15-16
      1.7.4 大量提取质粒DNA的相关溶液  16
      1.7.5 DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液及凝胶的配制  16
      1.7.6. 常用缓冲液的配制  16-17
    1.8 PCR引物  17
  2 实验方法  17-24
    2.1 单链复性  17
    2.2 PCR扩增  17-18
    2.3 酶切消化  18
    2.4 连接  18-19
    2.5 转化  19
    2.6 鉴定  19-20
    2.7 感受态细胞的制备  20
    2.8 质粒DNA的小提  20-21
    2.9 Western blotting的检测方法  21-22
    2.10 质粒DNA的大量提取  22-24
    2.11 重组质粒DNA浓度的测定  24
  3 实验结果  24-30
    3.1 优化H5蛋白,并合成H5蛋白基因  24-25
    3.2 构建克隆,并检测  25-26
    3.3 瞬时转染质粒Peak13 CD5L H5 TEV hFc,检测表达量  26
    3.4 扩增去跨膜端△TM H5蛋白基因  26-28
    3.5 瞬时转染细胞,检测蛋白的表达  28
    3.6 质粒大提  28-30
第二部分 构建稳定表达H5融合蛋白的细胞株  30-39
  1 实验材料  30-32
    1.1 细胞培养基及血清  30
    1.2 试剂  30
    1.3 细胞培养耗材  30
    1.4 仪器及设备  30-31
    1.5 细胞冻存液的配制  31
    1.6 细胞裂解液的配制  31
    1.7 蛋白质电泳及检测缓冲液  31
    1.8 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制  31-32
  2 实验方法  32-36
    2.1 DNA的纯化回收  32
    2.2 贴壁细胞培养  32
    2.3 稳定表达细胞株的构建  32-33
    2.4 细胞冻存  33
    2.5 细胞复苏  33
    2.6 细胞裂解  33-34
    2.7 Western blotting的检测方法  34-35
    2.8 ELISA检测方法  35-36
  3 实验结果  36-39
    3.1 质粒线性化并回收线性化的DNA  36
    3.2 将线性化的质粒转染细胞,构建稳定表达细胞株  36-37
    3.3 检测融合蛋白的正确表达,并测定表达量  37-39
第三部分 H5融合蛋白的纯化和生物活性检测  39-44
  1 实验材料  39
    1.1 试剂与耗材  39
    1.2 主要仪器与设备  39
  2 实验方法  39-41
    2.1 蛋白纯化  39-40
    2.2 用流式细胞技术检测表达蛋白的活性  40-41
  3 实验结果  41-44
    3.1 蛋白提纯  41
    3.2 融合蛋白的活性检测  41-44
      3.2.1 用MEF细胞检测融合蛋白的活性  41-42
      3.2.2 用HeLa细胞检测融合蛋白的活性  42-44
讨论  44-49
小结  49-51
参考文献  51-53
综述  53-63
简历  63-64
致谢  64

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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