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AiiA蛋白的表达和生物活性检测

作　者: 娄瑞娟
导　师: 宋水山
学　校: 河北工业大学
专　业: 生物化工
关键词: AiiA蛋白 毕赤酵母 活性检测 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 17次
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内容摘要


aiiA (N-acyl-homoserine lactonase, aiiA)基因编码的AiiA蛋白可以破坏植物病原细菌产生的信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones, AHLs)信号分子,干扰该信号分子介导的群体感应,减弱致病菌对植物产生的危害。构建携带N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)的重组毕赤酵母表达载体pPIC3.5K- aiiA,采用电转化方法导入毕赤酵母GS115,经营养缺陷型培养基、表型鉴定和高G418浓度筛选获得高拷贝表达盒的酵母转化子,用0.5%甲醇诱导表达,RT-PCR鉴定可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA,SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明, aiiA基因在毕赤酵母中成功表达,用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有降解N-酰基高丝氨酸内酯的活性。构建了分泌型表达载体pPIC9K-aiiA, SacⅠ酶切后,将其转化到毕赤酵母GS115,经过营养缺陷型培养基、表型鉴定和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子重组酵母菌GS115(pPIC9K-aiiA),目的菌株用甲醇诱导后,上清未见有目的蛋白条带出现,浓缩后的上清也没有活性,报告菌检测胞内蛋白提取物存在活性。将aiiA基因克隆到表达载体pET28a构建重组表达载体pET28a-aiiA,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,0.8mM IPTG诱导,SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明,实现了aiiA基因在大肠杆菌中的表达,报告菌检测目的蛋白AiiA具有很好的降解AHLs的活性。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-11
第一章 文献综述  11-22
  §1-1 群体感应  11-13
    1-1-1 革兰氏阴性细菌中的群体感应系统  11-12
    1-1-2 革兰氏阳性细菌中的群体感应系统  12-13
    1-1-3 细菌种间群体感应系统  13
  §1-2 群体感应的抑制  13-16
    1-2-1 对AHLs 合成途径的抑制  14
    1-2-2 破坏群体感应系统的受体蛋白  14
    1-2-3 对AHLs 与受体蛋白结合的抑制  14
    1-2-4 对AHLs 的降解  14-16
  §1-3 巴斯德毕赤酵母表达系统  16-21
    1-3-1 毕赤酵母酵母表达菌株  16-17
    1-3-2 毕赤酵母酵母表达载体  17
    1-3-3 启动子  17-18
    1-3-4 信号肽  18
    1-3-5 影响毕赤酵母高效表达的因素  18-20
    1-3-6 发展前景  20-21
  §1-4 课题研究的目的和意义  21-22
第二章 aiiA 基因在毕赤酵母中的表达及活性检测  22-47
  §2-1 材料  22-28
    2-1-1 供试菌株及载体  22
    2-1-2 引物  22-23
    2-1-3 主要试剂  23
    2-1-4 仪器设备  23-24
    2-1-5 培养基  24-25
    2-1-6 溶液配制  25-28
  §2-2 方法  28-37
    2-2-1 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞制备  29
    2-2-2 大肠杆菌的热激转化  29
    2-2-3 CTAB 法提取质粒DNA  29-30
    2-2-4 从琼脂糖凝胶中回收DNA 片段  30
    2-2-5 毕赤酵母表达载体的构建  30-32
    2-2-6 毕赤酵母感受态细胞的制备  32
    2-2-7 毕赤酵母电击转化  32-33
    2-2-8 重组毕赤酵母表型鉴定  33
    2-2-9 重组毕赤酵母的抗性筛选  33
    2-2-10 重组毕赤酵母的PCR 鉴定  33
    2-2-11 重组毕赤酵母RNA 提取  33-34
    2-2-12 反转录PCR (RT-PCR)  34-35
    2-2-13 重组酵母菌G5115(pPIC3.5k-aiiA)的诱导表达  35
    2-2-14 SDS-PAGE 分析  35-36
    2-2-15 银染法  36
    2-2-16 抗体纯化  36
    2-2-17 Western Blot 检测  36-37
    2-2-18 Dot Blot 检测  37
    2-2-19 毕赤酵母表达AiiA 蛋白活性的检测  37
  §2-3 结果  37-45
    2-3-1 AiiA 蛋白的胞内表达  37-41
      2-3-1-1 aiiA 基因真核表达载体pPIC3.5K -aiiA 的构建  37-39
      2-3-1-2 阳性重组子的筛选和鉴定  39-40
      2-3-1-3 RT-PCR 检测分析  40
      2-3-1-4 表达产物的SDS-PAGE 及Western Blot 分析  40-41
      2-3-1-5 表达产物的活性检测  41
    2-3-2 AiiA 蛋白的分泌表达  41-45
      2-3-2-1 aiiA 基因真核表达载体pPIC9K-aiiA 的构建  41-43
      2-3-2-2 毕赤酵母的电转化  43
      2-3-2-3 重组酵母菌的PCR 鉴定  43
      2-3-2-4 重组酵母菌的RT-PCR 鉴定  43-44
      2-3-2-5 AiiA 蛋白的诱导表达及活性检测  44-45
  §2-4 讨论  45-46
  §2-5 小结  46-47
第三章 aiiA 基因在大肠杆菌中的表达和活性检测  47-53
  §3-1 材料  47-48
    3-1-1 菌株  47
    3-1-2 载体  47
    3-1-3 主要试剂  47
    3-1-4 培养基  47
    3-1-5 溶液配制  47-48
    3-1-6 仪器设备  48
  §3-2 方法  48-49
    3-2-1 CTAB 法提取质粒DNA  48
    3-2-2 大肠杆菌DH5 感受态的制备和转化  48
    3-2-3 从琼脂糖凝胶中回收DNA 片段  48
    3-2-4 蓝白斑筛选  48
    3-2-5 重组表达质粒的构建  48-49
    3-2-6 基因工程菌BL21(pET28a-aiiA)诱导表达  49
    3-2-7 SDS-PAGE 分析  49
    3-2-8 Western Blot 检测  49
  §3-3 结果  49-52
    3-3-1 克隆载体的构建和酶切鉴定  49-51
    3-3-2 aiiA 基因在大肠杆菌BL21 的表达  51
    3-3-3 AiiA 蛋白的活性检测  51-52
  §3-4 小结  52-53
第四章 结论  53-54
参考文献  54-59
致谢  59-60
攻读学位期间所取得的相关科研成果  60

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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