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狐阴道加德纳氏菌的分离鉴定及快速诊断方法的研究

作　者: 葛中东
导　师: 刁有祥
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医
关键词: 狐阴道加德纳氏菌 分离鉴定 PCR 地高辛标记探针
分类号: S858.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


狐阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis of fox, GVF)是引起狐狸空怀、流产和死胎的主要病原之一。1987年,严忠诚、于国内外首次揭示该病为人畜共患病。狐阴道加德纳氏菌的微生物学特性有别于人体阴道加德纳氏菌,故定名为阴道加德纳氏菌狐亚种。银黑狐、北极狐、彩狐、赤狐、貉及水貂均易感染;病狐为主要的传染源,通过交配传播,并且怀孕的母狐可传染胎儿;该病一年四季均可发生,但于配种期感染率明显增高;不同品种、不同性别和不同日龄均可感染。近年来,狐阴道加德纳氏菌病的流行呈上升趋势,给我国毛皮动物饲养业中造成了严重的经济损失。本课题从发生流产的母狐脏器及死胎内分离并鉴定出4株狐阴道加德纳氏菌。并根据狐阴道加德纳氏菌16S r RNA基因设计引物,特异性扩增出437bp的核酸片段,建立了应用PCR检测狐阴道加德纳氏菌的方法;用地高辛标记PCR产物,制备出地高辛标记的核酸探针,建立了地高辛标记探针诊断方法,为狐阴道加德纳氏菌的诊断和流行病学调查提供了良好的技术指导。试验一狐阴道加德纳氏菌的分离鉴定本试验对山东省日照虎山镇送检的病死狐样品进行了狐阴道加德纳氏菌的分离及鉴定。对鉴定出的4株狐阴道加德纳氏菌进行药敏试验,结果表明该分离菌对万古霉素、复合磺胺敏感,而对卡那霉素、氨苄青霉素、头孢他啶等药物有耐药性。该研究为该病的预防、控制和临床治疗提供了有效的方法。试验二狐阴道加德纳氏菌PCR诊断方法的建立与应用根据狐阴道加德纳氏菌16S r RNA基因设计1对引物,特异性扩增出437bp的核酸片段,建立了应用PCR检测狐阴道加德纳氏菌的方法。特异性试验结果表明,狐阴道加德纳氏菌能扩增出437bp特异性的核酸片段,而大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为500个狐阴道加德纳氏菌。利用建立的PCR检测方法对9株从山东省不同地区分离的疑似菌株进行检测,结果4株为阳性。试验三狐阴道加德纳氏菌地高辛标记探针诊断方法的建立与应用利用PCR反应扩增出狐阴道加德纳氏菌16S r RNA基因437bp的DNA片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针与狐阴道加德纳氏菌核酸能发生特异性杂交,而与大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌细菌的核酸杂交均为阴性。对狐阴道加德纳氏菌的最低检出限量为103个菌,为狐阴道加德纳氏菌的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。

全文目录


中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-18
  1. 狐阴道加德纳氏菌的病原学  11-13
  2. 流行病学  13
  3. 临床症状  13
  4. 鉴别诊断  13-14
  5. 阴道加德纳氏菌病是一种人畜共患传染病  14-15
  6. 阴道加德纳氏菌病诊断方法  15
  7. 狐阴道加德纳氏菌病的防治  15-16
  8. 本课题研究的内容、目的和意义  16-18
试验一 狐阴道加德纳氏菌的分离鉴定  18-29
  1. 材料与方法  18-23
    1.1 材料  18-19
      1.1.1 病料来源  18
      1.1.2 试剂  18-19
      1.1.3 仪器及设备  19
    1.2 方法  19-23
      1.2.1 剖检及病变组织采集  19
      1.2.2 病原分离培养  19-20
      1.2.3 形态学观察  20-21
      1.2.4 生化鉴定  21-22
      1.2.5 菌种的保存  22-23
  2 结果  23-28
    2.1 剖检变化  23
    2.2 病原鉴定结果  23-25
      2.2.1 形态学鉴定  23
      2.2.2 生化鉴定  23-25
    2.3 药敏试验结果  25-28
  3 讨论  28-29
试验二 狐阴道加德纳氏菌PCR 诊断方法的建立与应用  29-34
  1 材料与方法  29-31
    1.1 材料  29-30
      1.1.1 仪器和试剂  29
      1.1.2 菌株  29
      1.1.3 PCR 引物  29
      1.1.4 细菌培养基  29-30
    1.2 方法  30-31
      1.2.1 细菌基因组 DNA 的抽提  30
      1.2.2 PCR 方法的建立  30
      1.2.3 PCR 扩增产物的检测  30
      1.2.4 PCR 产物的克隆及序列测定  30
      1.2.5 PCR 的特异性试验  30-31
      1.2.6 PCR 的敏感性试  31
      1.2.7 PCR 方法的初步应用  31
  2 结果  31-33
    2.1 特异性试验结果  31
    2.2 敏感性试验  31-32
    2.3 PCR 产物的克隆和序列测定  32
    2.4 PCR 对分离菌株的检测  32-33
  3 讨论  33-34
试验三 狐阴道加德纳氏菌地高辛标记探针诊断方法的建立与应用  34-41
  1 材料和方法  34-37
    1.1 材料  34-35
      1.1.1 仪器和试剂  34
      1.1.2 菌株  34-35
      1.1.3 PCR 引物  35
    1.2 方法  35-37
      1.2.1 细菌基因组 DNA 的抽提  35
      1.2.2 PCR 反应  35
      1.2.3 PCR 产物的克隆及序列测定  35
      1.2.4 探针的标记  35-36
      1.2.5 杂交检测程序  36
      1.2.6 特异性试验  36-37
      1.2.7 敏感性试验  37
      1.2.8 标记探针对分离菌株的检测  37
  2 结果  37-40
    2.1 PCR 结果  37-38
    2.2 PCR 产物的克隆和序列测定  38
    2.3 特异性试验  38
    2.4 敏感性试验  38-39
    2.5 标记探针对分离菌株的检测  39-40
  3 讨论  40-41
结论  41-42
参考文献  42-46
致谢  46

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 野生动物疾病
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