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凡纳滨对虾性腺抑制激素基因的克隆与表达

作　者: 姜姝娜
导　师: 李广丽；朱春华
学　校: 广东海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 凡纳滨对虾性腺抑制激素 RT-PCR 壬基酚表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

性腺抑制激素(gonad inhibiting hormone,GIH)是甲壳动物X-器官—窦腺复合体分泌的一种神经内分泌多肽类激素,对雌、雄个体的性腺发育、蜕皮及甲基法尼酯(methyl farnesoate,MF)的分泌均有抑制作用。本文以性腺发育成熟的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,利用RACE技术克隆获得GIH基因cDNA片段(含3’UTR),预测GIH基因编码的氨基酸序列,并利用生物信息学方法进行分析;利用半定量RT-PCR方法检测凡纳滨对虾八个不同发育时期(受精卵、无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾25天、仔虾30天、仔虾35天和仔虾40天),以及雌雄成体不同组织(肌肉、脑、眼柄、胃肠、鳃、心脏、卵巢和精巢)中的表达,并检测了环境内分泌干扰物壬基酚(nonylphenol,NP,100μg/L和0.01μg/L)对凡纳滨对虾雌虾眼柄中GIH基因表达的影响。结果表明:凡纳滨对虾GIH cDNA片段长为683bp,其中3’非编码区(3’UTR)为518bp,可读编码框162bp,编码54个氨基酸,在Poly(A)尾前15bp处存在AATAAA加尾信号。凡纳滨对虾GIH与斑节对虾相似性最高,达到96%,与刀额新对虾相似性为72%。通过与Genbank上已知氨基酸序列进行蛋白比对,发现凡纳滨对虾GIH中具有CHH蛋白家族共有的4个保守的半胱氨酸残基。凡纳滨对虾GIH基因在受精卵、幼体发育阶段及仔虾时期的眼柄中均有表达,35天时达到最高值(0.936±0.021),且与其他各期存在显著性差异(P<0.05),幼体发育阶段GIH表达量显著高于受精卵期(P<0.05),仔虾时期GIH表达量显著高于幼体阶段(P<0.05);在凡纳滨对虾雌、雄个体不同组织中,仅在眼柄和脑处检测到GIH基因的表达,表明凡纳滨对虾GIH基因与神经活动有关;NP处理抑制凡纳滨对虾雌性个体眼柄中GIH基因的表达且存在一定的剂量依存关系,但抑制效果不显著(P>0.05)。

全文目录

摘要 6-7Abstract 7-101 前言 10-19 1.1 X-器官—窦腺复合体 10-12 1.1.1 X-器官—窦腺复合体的超微结构 10-11 1.1.2 X-器官—窦腺复合体分泌的激素及其生理功能 11-12 1.2 性腺抑制激素（GIH）的国内外研究现状及发展动态 12-15 1.2.1 性腺抑制激素（GIH）的理化性质 12-13 1.2.2 性腺抑制激素（GIH）的组织分布 13 1.2.3 性腺抑制激素（GIH）的功能及作用机理 13-15 1.3 环境内分泌干扰物对甲壳动物性别分化相关基因的影响 15-16 1.4 凡纳滨对虾的生物学特征及研究现状 16-17 1.5 本研究的目的和意义 17-192 凡纳滨对虾性腺抑制激素（GIH）片段cDNA 及3’UTR 的克隆及序列分析 19-33 2.1 材料与方法 19-27 2.1.1 材料 19-22 2.1.2 方法 22-27 2.2 结果 27-32 2.2.1 凡纳滨对虾眼柄总RNA 的提取 27 2.2.2 GIH cDNA 中间片段及 3’UTR 扩增结果 27-28 2.2.3 转化菌落的PCR 鉴定 28-30 2.2.4 凡纳滨对虾GIH 片段cDNA 序列分析 30 2.2.5 进化树分析 30-32 2.3 讨论 32-333 GIH m RNA 的时空表达 33-41 3.1 材料与方法 33-36 3.1.1 材料 33 3.1.2 方法 33-36 3.2 结果 36-39 3.2.1 Litβ-actin 的RT-PCR 扩增结果及序列分析 36 3.2.2 循环数对PCR 产物灰度的影响 36-37 3.2.3 凡纳滨对虾雌雄成体各组织中GIH m RNA 的表达 37 3.2.4 凡纳滨对虾早期发育不同时期GIH m RNA 的表达 37-39 3.3 讨论 39-414 壬基酚干扰对凡纳滨雌虾眼柄性腺抑制激素（GIH）m RNA 表达水平的效应 41-44 4.1 材料与方法 41-42 4.1.1 材料 41 4.1.2 方法 41-42 4.2 结果 42-43 4.3 讨论 43-445 结论 44-45参考文献 45-51致谢 51-52作者简介 52-53导师简介 53

凡纳滨对虾性腺抑制激素基因的克隆与表达

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