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转基因稻米及其米制品外源重组DNA的检测

作　者: 宋尚新
导　师: 周光宏
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 转基因水稻 DNA提取 多重PCR 食品加工 DNA降解
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本文旨在建立转基因稻米香125S/Bar68-1及其米制品外源重组DNA的PCR检测方法,并研究其外源重组DNA在米制品加工过程中的降解情况,为我国转基因水稻的检测、安全评估及在食品链中的溯源研究提供技术和理论支持。本研究主要包括以下三部分：实验一旨在建立一种简单、快速、有效的转基因稻米DNA提取方法,为后续建立转基因稻米的PCR检测方法奠定基础。实验以转基因糙米、非转基因糙米和转基因精米为材料,选择传统的CTAB法、改良碱处理法和高温水煮法提取各样品中的DNA,每个处理设置6个重复。由DNA提取物的检测结果得知：改良碱处理法提取的DNA的完整性、纯度和PCR反应三个方面与传统的CTAB法相近,且比CTAB法的产率高、耗时短、成本低。因此改良的碱处理法可以代替传统的CTAB法用于转基因稻米检测中DNA模板的制备。实验二旨在建立一种转基因稻米及其米制品的四重PCR检测方法,为食品链中转基因稻米及其米制品的快速检测提供技术和理论支持。实验以转Bar基因稻米SPS基因、CAMV35S启动子、Bar基因、NOS终止子为模板设计四对引物,通过引物浓度和退火温度的优化建立四重PCR检测方法为：反应体系12.5μL PCR Mix, CAMV35S、Bar、SPS和NOS引物添加量分别为0.5、0.2、1.0、0.5μL, 100ng DNA模板,加水至25μL；反应条件：预变性94℃5min；变性94℃1min,退火57℃1min,延伸72℃1min,40个循环；72℃延伸7min。结果表明：建立的四重PCR检测方法具有较好的特异性,可用于转基因稻米及其米制品的检测。实验三旨在研究转基因稻米外源重组DNA在米制品加工过程中的降解情况,为我国食品链中转基因稻米的检测及安全评估提供技术和理论支持。实验以转Bar基因精米为主要原料制作甜米酒和米果,选择CTAB法和改良碱处理法提取米制品中的DNA,并对SPS基因、CAMV35S启动子、Bar基因和NOS终止子进行不同大小片段的PCR扩增。结果表明：采用碱处理法提取的米制品DNA的纯度、质量浓度和PCR反应三个方面均优于CTAB法；在米酒发酵过程中,SPS基因在发酵第一天开始出现降解,CAMV35S启动子和NOS终止子在发酵第三天开始降解,而Bar基因在发酵四天里都没有降解,发酵结束后能够检测到的SPS, Bar, CAMV35S和NOS的最长片段分别为916,568,446和180bp；在米果加工过程中,煮制、干燥和微波导致了三种外源成分的初始降解,焙烤导致了进一步的降解,油炸导致的降解最严重,油炸处理后的米果中可以检测到的最大SPS基因和CAMV35S启动子的片段为168bp和446bp,而Bar基因和NOS终止子在本研究的引物条件下没有被检测到。由此可知,碱处理法能够快速、有效的提取转基因稻米制品中DNA,转基因稻米中的各种外源成分在不同加工条件下的稳定性不同。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10缩略词中英文对照表  10-11前言  11-13文献综述  13-33  1 转基因水稻品种培育研究进展  13-17    1.1 抗除草剂转基因水稻  13-15      1.1.1 转Bar基因水稻  13-14      1.1.2 转抗EPSPS抑制剂基因水稻  14-15      1.1.3 转细胞色素P450单氧合酶基因水稻  15    1.2 抗虫转基因水稻  15-17    1.3 本实验研究的转基因水稻  17  2 转基因水稻的安全性评价  17-20    2.1 转基因水稻的污染事件  17-18    2.2 转基因水稻外源基因的安全性评价  18-20  3 转基因水稻基因检测方法  20-23    3.1 水稻DNA提取方法  20-21    3.2 多重PCR检测方法  21-22    3.3 定量PCR检测方法  22-23  参考文献  23-33试验研究  33-65  第一章 转基因稻米检测中DNA提取方法的建立  33-43    1 材料与方法  33-35      1.1 材料与分组  33      1.2 主要试剂  33-34      1.3 主要实验仪器  34      1.4 DNA提取方法  34      1.5 DNA提取物质量浓度和纯度检测  34      1.6 PCR扩增反应  34-35      1.7 电泳条件  35      1.8 数据处理  35    2 结果与分析  35-38      2.1 DNA提取物产率和纯度的检测结果  35-37      2.2 PCR扩增结果  37-38    3 讨论  38-40    4 结论  40    参考文献  40-43  第二章 转基因稻米及米制品多重PCR方法的建立  43-51    1 材料与方法  43-44      1.1 材料  43      1.2 DNA提取方法  43      1.3 DNA浓度和纯度的测定  43      1.4 引物设计  43-44      1.5 常规PCR扩增条件  44      1.6 四重PCR的退火温度优化  44      1.7 四重PCR的引物浓度优化  44    2 结果与分析  44-48      2.1 DNA提取物的纯度和质量浓度  44-45      2.2 常规PCR扩增结果  45-46      2.3 四重PCR的退火温度优化结果  46      2.4 四重PCR的引物浓度优化结果  46-47      2.5 四重PCR检测方法的验证结果  47-48    3 讨论  48-49    4 结论  49    参考文献  49-51  第三章 转基因稻米外源重组DNA在米制品加工过程中的降解研究  51-65    1 材料与方法  51-54      1.1 材料  51      1.2 甜米酒的制作方法  51      1.3 米果的制作方法  51-52      1.4 DNA提取方法  52      1.5 引物设计  52-54      1.6 PCR反应条件  54      1.7 数据处理  54    2 结果与分析  54-60      2.1 DNA提取物检测结果  54-56      2.2 甜米酒及米果中SPS基因的PCR检测结果  56      2.3 甜米酒及米果中CAMV35S启动子的PCR检测结果  56-58      2.4 甜米酒及米果中Bar基因的PCR检测结果  58      2.5 甜米酒及米果中NOS终止子的PCR检测结果  58-60    3 讨论  60-62    4 结论  62    参考文献  62-65全文结论  65-67致谢  67-69攻读硕士学位期间论文发表情况  69

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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