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褪黑素增强阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用及其机制研究

作　者: 汪文生
导　师: 孙国平
学　校: 安徽医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 褪黑素多柔比星 HepG2细胞药物协同作用凋亡
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一,其发病率为30.3/10万,占所有癌症的13.13%,居第3位,近二十年来,死亡率增加了41.7%,约占全世界HCC死亡人数的42%。近年来,由于丙型肝炎病毒感染增加,肝癌的发病率在发达国家也有上升的趋势。目前,手术切除仍是治疗HCC的最佳手段。但是80%的患者在诊断时已属晚期,失去手术机会,而对于那些手术患者,其两年内的复发率也高达50%。化疗是肿瘤治疗的重要手段,但对肝癌的疗效尚令人失望。作为肝癌治疗最常见的药物——阿霉素(Doxorubicin, Dox)其有效率也仅为4%~10.5%,并且其毒副反应又进一步限制了其临床应用。目前,诸多医家开始对中草药及人体内部本身所存在的抗肿瘤物质进行了深入的探讨和研究,褪黑素就是其中之一。褪黑素(melatonin, Mel)主要是松果体分泌的一种吲哚胺类激素,化学成分为N-乙酰-5-甲氧基色胺,是一种重要的生理性肿瘤抑制剂,具有广泛的生物学效应。其分泌量有明显的昼夜节律,有利于睡眠,还可以抑制肿瘤细胞生长,增强人体免疫系统的功能。褪黑素作为机体内的一种天然抑瘤因素物质越来越受到重视。动物实验表明,Mel能显著抑制小鼠移植性肝癌的生长,并能抑制癌细胞的转移。本研究选用肝癌HepG2细胞株作为实验对象,观察Mel联合Dox对HepG2细胞的增殖抑制作用,探讨其可能的作用机制,以期为肝癌的临床治疗提供新的方法。目的探讨褪黑素联合阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用及其对Bax, Caspase-3, Bcl-2表达的影响。方法采用MTT法测定Mel联合Dox对HepG2细胞的增殖抑制情况;原位细胞凋亡检测法(Terminal deoxynucleotidy transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)观察细胞凋亡形态学变化;流式细胞仪(Flow Cytomtry, FCM)检测凋亡率;免疫细胞化学技术检测Bax, Caspase-3, Bcl-2蛋白的表达情况。1 Mel联合Dox对HepG2细胞的增殖抑制作用采用MTT法,分别观察了Mel和Dox单独以及Mel联合Dox对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果显示:(1)Mel(10-8~10-5mmol/L)对HepG2细胞有增殖抑制作用,呈明显的剂量和时间依赖性。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析:r=0.993,P<0.01;IC50为7.623×10-5;(2)Dox(0.31~2.5mg/L)对HepG2细胞有增殖抑制作用,呈剂量依赖性。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析:r=0.9231,P<0.01;IC50为0.56mg/L;(3)不同浓度的Mel(10-8、10-7、10-6、10-5mmol/L)分别与系列浓度Dox(0.31~2.5mg/L)联合对HepG2细胞有增殖抑制作用。采用CDI分析两药相互作用性质,结果发现,在合适的剂量下,Mel与Dox有协同作用(CDI<1)。2 Mel与Dox联合对人肝癌细胞株HepG2凋亡影响采用末端双脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)观察HepG2细胞凋亡的形态学改变。典型的凋亡细胞形态特征包括核固缩、体积缩小、核染色质边集等。研究发现对照组细胞增殖旺盛,可见少许凋亡细胞;药物作用上述细胞48h后,细胞密度明显减少,凋亡细胞数明显增加,以联合用药组最显著。应用流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)检测细胞凋亡率。在DNA图谱G0/G1期前出现了一个代表细胞凋亡的亚G1峰即凋亡峰。FCM结果显示,正常对照组可见低矮的凋亡峰,药物处理48h后,其凋亡峰增加,以联合用药组最为显著,提示两药合用有协同诱导HepG2细胞凋亡作用。3 Mel联合Dox诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的可能分子机制采用细胞免疫组化法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3表达情况。结果表明,HepG2细胞中,Bcl-2、Bax和Caspase-3均有不同程度表达。药物处理后HepG2细胞Bcl-2表达降低,而Bax和Caspase-3表达增加,以联合用药组最为显著。结论本结果表明一定浓度的Mel能增强Dox对HepG2细胞株的增殖抑制与诱导凋亡作用,其作用机制可能与上调Bax、Caspase-3,下调Bcl-2表达有关。

全文目录

英文缩略词表  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-15
1 前言  15-16
2 实验材料  16-18
  2.1 细胞株  16
  2.2 药物及试剂  16-17
  2.3 仪器与设备  17
  2.4 常用液的配制  17-18
3 实验方法  18-21
  3.1 细胞培养与传代  18
  3.2 细胞活力测定  18
  3.3 体外增殖抑制实验  18-19
  3.4 药物联合作用评价  19
  3.5 末端双脱氧核苷酸转移酶倡导的 dUTP 缺口标记技术检测细胞凋亡  19-20
  3.6 流式细胞术检测细胞凋亡  20
  3.7 免疫细胞化学法检测 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 表达的影响  20-21
  3.8 数据的统计  21
4 结果  21-34
  4.1 褪黑素对 HepG2 细胞的增殖抑制作用  21-24
  4.2 Mel 增强 Dox 对人肝癌细胞株 HepG_2 的增殖抑制作用  24-28
  4.3 Mel 与 Dox 联合对人肝癌细胞株 HepG_2 凋亡影响  28-30
    4.3.1 Mel 与 Dox 联合对人肝癌细胞株 HepG_2 凋亡的 TUNEL 分析  28-29
    4.3.2 Mel 与 Dox 联合对人肝癌细胞株 HepG_2 凋亡的 FCM 检测  29-30
  4.4 Mel 增强 Dox 诱导人肝癌细胞 HepG_2 凋亡的可能分子机制  30-34
5 讨论  34-40
  5.1 Mel 对人肝癌细胞的 HepG2 的增殖抑制作用  35-36
  5.2 Mel 增强 Dox 对人肝癌 HepG2 细胞的增殖抑制作用  36-37
  5.3 Mel 增强 Dox 的诱导凋亡作用  37-38
  5.4 Mel 诱导肿瘤细胞凋亡的可能分子机制  38-40
6 结论  40
7 参考文献  40-45
附录  45-46
  本人简历  45
  在学期间的研究成果  45-46
致谢  46-47
综述褪黑素抗肿瘤研究进展  47-59

褪黑素增强阿霉素对HepG2细胞株的增殖抑制作用及其机制研究

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