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秦川牛胎儿成纤维细胞Myostatin基因打靶的研究

作　者: 刘永刚
导　师: 张涌
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: Myostatin基因基因打靶定点突变胎儿成纤维细胞秦川牛
分类号: S823.81
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Myostatin (MSTN,肌肉生长抑制素)基因又称GDF-8,属于TGF-β(transforming growing factor )超家族成员之一,对骨骼肌的生长发育具有负调控作用。研究证明该基因的功能缺失,能够引起肉用动物的“双肌”表型。本研究探讨了通过基因打靶定点突变的方法,将C313Y突变点引入秦川牛胎儿成纤维细胞 Myostatin基因第三外显子中,改变该基因的生物学功能,为核移植方法生产高产肉率转基因秦川牛提供供体细胞。基因打靶技术是制作转基因动物的常用方法,将外源DNA片段转染到受体细胞内,与受体细胞基因组上的靶位点发生同源重组,从而对受体细胞内源基因进行修饰。在本研究中构建了两个置换型打靶载体pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2。通过PCR方法,以秦川牛全基因组为模板,扩增了三段Myostatin基因序列,作为构建打靶载体的同源臂,其中两段较长序列4.0kb和3.2kb,分别作为打靶载体pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2的同源长臂,一段较短序列1.6kb作为它们共用的同源短臂。采取妊娠45日龄的秦川牛胎儿,胰酶消化法分离培养胎儿成纤维细胞,并通过MTT法测定其生长曲线,结果显示细胞增殖活力良好,可以作为基因打靶受体细胞。此外,还对电转染胎儿成纤维细胞参数进行了优化。设定了五组电转染参数,按照每组参数将线性化的pEGFP-C1载体电转染胎儿成纤维细胞,36 h后通过荧光显微镜观察并粗略估计每组参数的转染效率,结果显示电转参数1250 V/cm;1ms;3次为最佳条件,转染效率为40 %左右。通过脂质体法转染胎儿成纤维细胞,转染效率在20%左右。通过电转染方法,将线性化的打靶载体pA2T-Mstn4.0和pA2T-Mstn3.2转染秦川牛胎儿成纤维细胞,经过600μg/mL G418和50 nmol/L GCV的药物正负筛选,分别得到了62个和110药物抗性细胞单克隆。对细胞单克隆提取基因组,进行PCR鉴定,并回收PCR阳性条带,进行测序验证。对经PCR鉴定呈阳性的细胞单克隆扩增培养,提取细胞全基因组进一步进行Southern blotting鉴定。鉴定结果显示,打靶载体pA2T-Mstn4.0转染的第58号细胞克隆为发生了正确同源重组的细胞克隆,Myostatin基因的一个等位基因打靶成功。本研究为通过基因打靶技术及核移植技术制作高产肉率转基因肉牛建立了技术平台,对加快肉牛品种的改良具有重要意义。

秦川牛胎儿成纤维细胞Myostatin基因打靶的研究

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