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苔藓细胞色素P450及小G蛋白PpRan基因的克隆及分析

作　者: 叶帅
导　师: 朱正歌；高建伟
学　校: 河北师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 苔藓细胞色素P450 PpRan 基因打靶
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

苔藓(P. patens)是目前发现的唯一具有高频率同源重组特性的植物。基因打靶技术的核心是同源重组,由于结果的可预见性和准确性,基因打靶已成为功能基因组学研究的常规技术。苔藓(P. patens)生命周期短,易于培养,而且其个体小,易于转化(PEG介导的原生质体转化),再生力极强,有利于高通量规模化培养和突变体筛选。苔藓植物也有世代交替,但其单倍体的配子体世代占优势,这利于快速构建突变体和遗传性状的直接分析。因此,苔藓在整个植物功能基因组学研究中具有代表性。本研究以苔藓(P. patens)为模式系统,对苔藓细胞色素P450和小G蛋白PpRan基因进行了相关研究。细胞色素P450是一类具有混合功能且含血红素的氧化还原酶。植物细胞色素P450参与多种代谢途径,包括参与植物体的基础代谢和植物次生代谢,植物P450基因功能研究一直倍受国内外科学家重视。本研究克隆了苔藓的4个细胞色素P450基因,利用同源重组技术对这4个P450基因实施定点突变,成功构建了诱导其功能缺失的载体;同时我们将利用P450promoter::cDNA::GFP融合技术研究细胞色素P450的亚细胞定位。根据得到的细胞色素P450基因功能缺失突变体的表型变化及细胞色素P450的亚细胞定位结果来研究P450基因的功能。本研究成功构建了这4个P450基因的功能缺失载体并转化苔藓,已得到CYP73A49基因缺失的苔藓,目前还没有观察到明显的表型变化,需要进一步进行生理生化方面的研究。P450promoter::cDNA::GFP融合蛋白载体的亚细胞定位的研究正在进行中。Ran是一种大量分布于细胞核内的小分子的GTP酶,在核质运输过程中具有十分重要的作用,而且还参与调控细胞分裂及其信号传导的功能。本研究利用基于同源序列的PCR技术,成功克隆了PpRan基因组序列及cDNA序列,并对苔藓PpRan基因编码的氨基酸保守序列进行了相关分析。利用半定量PCR技术对PpRan基因在苔藓不同组织中以及苔藓受到缺磷胁迫时的表达研究发现:PpRan基因的表达具有组织特异性,茎叶体和原丝体中表达量较高,假根中表达量比较低;PpRan基因受缺磷胁迫诱导表达,随着缺磷胁迫时间的延长表达量越来越高。

全文目录

中文摘要  3-4
英文摘要  4-8
引言  8-9
1 文献综述  9-21
  1.1 苔藓（P. patens）—植物代谢与发育研究的理想模式系统  9-14
    1.1.1 引言  9
    1.1.2 生命周期  9-10
    1.1.3 代谢研究  10-11
    1.1.4 发育研究（激素的合成与作用）  11-14
    1.1.5 小结与展望  14
  1.2 细胞色素 P450 研究简介  14-17
    1.2.1 引言  14-15
    1.2.2 细胞色素P450的生化特征  15
    1.2.3 细胞色素P450 参与苯丙烷类物质代谢途径  15-16
    1.2.4 细胞色素P450 基因参与植物生长素的合成  16
    1.2.5 细胞色素P450 基因参与芥子油甙代谢  16
    1.2.6 前景与展望  16-17
  1.3 低分子量G 蛋白Ran 研究概况  17-21
    1.3.1 引言  17
    1.3.2 低分子量GTP 结合蛋白  17
    1.3.3 低分子量GTP 结合蛋白Ran 功能的研究  17-20
    1.3.4 问题与展望  20-21
2 苔藓细胞色素P450 基因的克隆与分析  21-49
  2.1 材料与方法  21-35
    2.1.1 材料与试剂  21
    2.1.2 方法  21-35
  2.2 结果与分析  35-47
    2.2.1 细胞色素P450 cDNA 编码序列的克隆与分析  35-42
    2.2.2 细胞色素P450基因组DNA的克隆与分析  42-43
    2.2.3 P450promoter::cDNA::GFP 融合蛋白载体的酶切鉴定  43-44
    2.2.4 潮霉素（hpt）筛选标记的克隆  44
    2.2.5 细胞色素P450功能缺失载体的PCR及酶切鉴定  44-46
    2.2.6 PEG介导的苔藓原生质体转化结果鉴定  46-47
  2.3 讨论  47-49
3 苔藓PpRan 基因的克隆与表达研究  49-59
  3.1 材料与方法  49-51
    3.1.1 材料与试剂  49
    3.1.2 方法  49-51
  3.2 结果与分析  51-56
    3.2.1 苔藓PpRan基因组DNA及cDNA的克隆及分析  51-55
    3.2.2 苔藓PpRan 基因的组织表达特异性分析  55-56
    3.2.3 苔藓受缺磷胁迫时PpRan 基因的表达特性分析  56
  3.3 讨论  56-59
4 结论和后续工作  59-61
  4.1 结论  59
  4.2 后续工作  59-61
参考文献  61-69
附录  69-73
缩写表  73-74
致谢  74-75
攻读学位期间科研成果  75

苔藓细胞色素P450及小G蛋白PpRan基因的克隆及分析

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