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植物气味分子与苜蓿盲蝽化学感受蛋白识别结合特性研究

作　者: 马双
导　师: 郝再彬
学　校: 东北农业大学
专　业: 植物学
关键词: 苜蓿盲蝽化学感受蛋白表达谱分析 Y型管嗅觉仪荧光竞争结合定点突变
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

昆虫通过灵敏的嗅觉系统来识别环境中复杂的化学信号,如配偶释放的性信息素或植物的挥发性气味化合物,从而引起昆虫的择偶,交配,定位寄主植物,寻找产卵场所等行为。在昆虫的嗅觉识别过程中,不同种类的植物气味化合物在不同的载体蛋白的帮助下穿过化学感受器中的极性淋巴液,到达分布于触角嗅觉感器的特化上皮中的特殊神经元或一般化学感受系统的特殊神经元,并与其上的气味受体作用,引起嗅觉神经冲动,进而引起昆虫的各种行为反应。许多研究表明小分子可溶性化学感受蛋白在传递疏水性气味化合物到达气味受体的过程中作为载体蛋白起到了重要的作用。利用昆虫的嗅觉识别机制,以CSPs作为潜在的靶标基因,干扰昆虫的寄主定位及交配等行为,用于害虫综合治理已成为当今研究的热点问题。具有理论和实际的意义。苜蓿盲蝽作为我国的主要害虫之一,对我国的棉花等重要作物的生产造成了严重的经济损失,因此本实验以苜蓿盲蝽的化学感受蛋白为目标,采用qPCR法研究了其在苜蓿盲蝽不同发育阶段及不同组织中的表达情况,利用原核表达系统进行化学感受蛋白AlinCSPs的表达,纯化出可溶的重组化学感受蛋白,以同源建模的方法得到了苜蓿盲蝽化学感受蛋白的三维结构并对可能的结合位点进行了预测,并通过定点突变的方法及荧光竞争结合实验来验证。进行荧光竞争结合实验,筛选出结合能力强的植物气味化合物,以这些植物气味化合物为处理,选择空气为对照,用Y型管对苜蓿盲蝽成虫进行了嗅觉行为测试,主要研究结果如下:1.本实验利用原核表达系统,克隆、表达、纯化了3个新的苜蓿盲蝽化学感受蛋白(AlinCSP4,AlinCSP5,AlinCSP6)。选择β-actin基因为内参基因,以苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP4,AlinCSP5,AlinCSP6,AlinCSP7,AlinCSP8基因为目的基因,运用qPCR的方法研究了目的基因在苜蓿盲蝽不同发育阶段(1龄,2龄,3龄,4龄,5龄,6龄)和不同组织(触角,头,胸,腹,足,翅)中的相对表达量。在苜蓿盲蝽目的基因与内参基因扩增效率一致的情况下,利用公式2-△△CT直接算出AlinCSPs的表达量。实验结果表明AlinCSP4,AlinCSP5,AlinCSP8,以及AlinCSP7主要在苜蓿盲蝽的2龄若虫中表达,据此我们可以推测AlinCSP4,AlinCSP5,AlinCSP8和AlinCSP7在苜蓿盲蝽的早起发育中起重要的作用。而AlinCSP6则主要在苜蓿盲蝽成虫中表达。AlinCSP4和AlinCSP6主要在苜蓿盲蝽的足中表达,AlinCSP5和AlinCSP8则主要在苜蓿盲蝽的触角中表达。而AlinCSP7主要在苜蓿盲蝽的翅中表达,这表明AlinCSP7在苜蓿盲蝽的翅形成过程中可能起重要的作用。2.采用3D-Jury方法(Ginalski等,2003)对CSP4,CSP5,CSP6的氨基酸序列进行分析,获得模板。使用Discovery Studio 2.0软件(Accelrys Software Inc.)构建三维模型。使用profiles-3D方法(Luthy等,1992)以及拉氏图(Ramachandran等,1963)对模型的有效性进行验证。模型确定后,使用Discovery Studio2.0对模型搜索配体结合区域。结果表明AlinCSP4结构包括6个α-螺旋结构,分别为17-22(α1),24-34(α2),40-56(α3),64-80(α4),84-92(α5) and 97-105(α6),及两个二硫桥键Cys33-Cys40和Cys59-Cys62,此外,推测Ile78, Trp85, Ile51和Phe52在气味化合物的结合中起重要作用。AlinCSP5的三维结构表明,AlinCSP5具有一个大的疏水性口袋结构,并推测Ile67为其中的一个可能的结合位点。AlinCSP6的3D结构显示该蛋白主要由6个α螺旋构成,分别是13-18(α1),20-32(α2),39-52(α3),59-76(α4),78-88(α5)和94-102(α6)。Cys29-Cys36和Cys55-Cys58两个二硫键起着稳定蛋白结构的作用。推测AlinCSP6的Ile74和Phe81基团能够参与结合油酸酰胺或其类似物;推测AlinCSP6具有较广泛的气味结合谱,在苜蓿盲蝽嗅觉过程中具有重要作用。3.在荧光竞争结合实验中,选择了114种植物气味分子与AlinCSP4的结合特性,实验结果表明,AlinCSP4具有广泛的结合谱,除了烯类化合物以外,能够与醇类,醛类,酮类,酯类,芳香族类等气味化合物结合,其中(±) 2-undecanol, 2-butyl-1-octanol, 2-nonancne, 2-pentadecanone, nonylacetat, ethyl2-methylbutyrate, methyl jasmonate, limonene, 2-terpinene, myrcene, 1,8-cineole, ethyl ether, 3,4-dimethyl benzaldehyde, 4-ethylbenzaldehyde和benzaldehyde与AlinCSP4的结合能力最强,两种信息素butyl butanoate和1-hexyl butyrate也与AlinCSP4具有明显的结合能力。选择了50种植物挥发性气味化合物研究了AlinCSP5的结合特性,荧光竞争结合实验表明AlinCSP5的结合具有特异性,它能特异的结合β-citronellol, 3-Hexanone, 2-Octanone, acetophenone, 2,3-dimethyl-benzoic acid, 3,4-Dinethylbenzaldehyde, Isoborneol,β-lonone,其中acetophenone与AlinCSP5表现出的结合能力最强,IC50值为16.305μmol/L。选择了113种植物气味分子对AlinCSP6的荧光竞争性结合实验。结果表明,AlinCSP6具有较广谱的结合力,能够与醇,醛,酮,酯,萜,芳香族等多种化合物结合并表现较强的结合能力。其中,β-香茅醇β-citronellol,反式-2-己烯醛Trans-2-hexene aldehyde,6-甲基-5-庚烯-2-酮6-methyl-5-Heptene-2-ketone,2-十一烷酮2-Undecanone,乙酰丙酸丁酯Butyl levulinate,月桂烯myrcene,左旋-β-蒎烯(1s)-(-)-β-Pinene,壬烷nonane,3,4-二甲基苯甲醛3,4-dimethyl benzaldehyde,乙醚Ethyl ether,罗勒烯Ocimene,苯乙酮Acetophenone,苯甲醛benzaldehyde与AlinCSP6有很强的结合力。4.利用定点突变的方法将AlinCSP5第67位的异亮氨酸残基ILe突变成丙氨酸Alanine残基,突变成AlinCSP5 I67A突变体,并对突变体进行表达纯化,进行荧光竞争结合实验,结果表明,Ile67突变体不能与β-Citronellol和2,3-Dimethylbenzoic acid相结合。3-hexanone和acetophenone的结合能力变化不大, 2-octanone, 3,4-Dimethylbenzaldehyde,β-lonone和Isoborneol的结合能力显著上升。我们推测位于疏水性口袋结构处的疏水性氨基酸参与了气味化合物的最初识别,并与化学感受蛋白的特异性结合有关。5.在Y型管嗅觉仪实验中醇类化合物异樟醇(+-)-Isoborncol,3 -己醇3-hexanol,二丁基辛醇2-butyl-1-octanol,醛类化合物正庚醛Heptanal,酮类化合物2-庚酮2-Heptanone,β-紫罗兰酮β-lonone,2-辛酮2-octanone,2-己酮2-hexanone,6-甲基-5-庚烯-2-酮6-methyl-5-Heptene -2-Ketone,萜类化合物R-(+)-柠檬烯R-(+)-limonene,α-松油烯α-terpinene,香芹醇carveol,α-水芹烯α-phellandrene,烃类化合物戊烷pentane,十一烷undecane,杂环类化合物β-蒎烯β-Pinene,芳香族类化合物对乙基苯甲醛4-Ethylbenzaldehyde,醚类化合物吲哚Indole对苜蓿盲蝽成虫有强烈的引诱作用,而苯乙酮Acetophenone,反式-2-己烯醛Trans-2 -hexene aldehyde,辛醛oclanal对苜蓿盲蝽成虫有剧烈的趋避作用。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-13
1 引言  13-22
  1.1 植物挥发物与昆虫行为关系的研究进展  13-15
    1.1.1 植物挥发物的种类  13-14
    1.1.2 植物挥发物的产生  14
    1.1.3 植物挥发物对昆虫寄主选择行为的影响  14
    1.1.4 植物挥发物对昆虫产卵行为的影响  14-15
    1.1.5 植物挥发物对昆虫取食行为的影响  15
  1.2 昆虫化学感受蛋白研究进展  15-19
    1.2.1 化学感受蛋白的种类  15-16
    1.2.2 昆虫化学感受蛋白的分子结构  16-17
    1.2.3 化学感受蛋白的表达分布情况  17-18
    1.2.4 化学感受蛋白的功能  18-19
  1.3 Y 型嗅觉仪的应用现状  19-20
    1.3.1 Y 型嗅觉仪的工作原理  19-20
    1.3.2 Y 型嗅觉仪的应用  20
  1.4 研究的目的和意义  20-22
2 材料与方法  22-28
  2.1 试验材料  22
    2.1.1 供试昆虫  22
    2.1.2 供试样品与试剂  22
    2.1.3 主要的试验设备  22
  2.2 试验方法  22-28
    2.2.1 RNA 的提取  22-23
    2.2.2 第一链cDNA 的合成  23
    2.2.3 苜蓿盲蝽AlinCSPs 基因的引物设计  23
    2.2.4 苜蓿盲蝽AlinCSPs 基因的PCR 扩增  23-24
    2.2.5 苜蓿盲蝽化学感受蛋白基因的克隆﹑表达及纯化  24
    2.2.6 包涵体处理  24
    2.2.7 苜蓿盲蝽CSPs 基因组织表达谱  24-25
    2.2.8 扩增效率一致性验证及数据处理  25
    2.2.9 AlinCSPs 的三维结构模拟  25-26
    2.2.10 荧光竞争结合实验  26
    2.2.11 定点突变和突变体的表达  26-27
    2.2.12 Y 型管嗅觉仪  27-28
3 结果与分析  28-63
  3.1 苜蓿盲蝽化学感受蛋白的克隆、表达、纯化及表达谱分析  28-37
    3.1.1 AlinCSP6 的克隆﹑表达及纯化  28-29
    3.1.2 AlinCSP4 的克隆﹑表达及纯化  29-31
    3.1.3 AlinCSP5 的克隆﹑表达及纯化  31-32
    3.1.4 扩增效率一致性验证  32
    3.1.5 苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSPs 组织表达谱分析  32-37
  3.2 苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSPs 的3D 结构模拟及结合位点预测  37-43
    3.2.1 AlinCSP4 的三维结构模拟  37-40
    3.2.2 AlinCSP5 三维结构模拟  40
    3.2.3 AlinCSP6 三维结构模拟  40-43
  3.3 植物挥发性气味分子与苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSPs 的结合特性  43-55
    3.3.1 AlinCSP4 的荧光结合实验  43-48
    3.3.2 AlinCSP5 的荧光结合实验  48-51
    3.3.3 AlinCSP6 的荧光结合实验  51-55
  3.4 定点突变检测苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP5 可能结合位点  55-59
    3.4.1 AlinCSP5 的结合特性  55-56
    3.4.2 AlinCSP5 的定点突变及突变体的结合特征  56-59
  3.5 苜蓿盲蝽对60 种植物气味化合物的趋向行为研究  59-63
4 讨论  63-68
  4.1 苜蓿盲蝽化学感受蛋白基因表达谱分析  63
  4.2 苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP4 的气味结合特性及其行为反应验证  63-65
  4.3 苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP5 的结合特性及预测结合位点功能  65-66
  4.4 苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP6 的结合特性  66-68
5 结论  68-70
  5.1 苜蓿盲蝽化学感受蛋白基因表达谱分析  68
  5.2 苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP4 的气味结合特性及其行为反应验证  68
  5.3 苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP5 的结合特性及预测结合位点功能  68
  5.4 苜蓿盲蝽化学感受蛋白AlinCSP6 的气味结合特性  68-70
致谢  70-71
参考文献  71-80
攻读硕士学位期间发表的学术论文  80

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