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K.pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶高效催化特性的研究

作　者: 吕波
导　师: 李春
学　校: 石河子大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 甘油脱水酶 定点突变 1,3-丙二醇 yqhD K. pneumoniae XJPD-Li
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 9次
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内容摘要


利用甘油或葡萄糖等可再生资源为原料生物合成1,3-丙二醇（1,3-PD）具有生产清洁、对环境无污染的“绿色化学”特征,符合21世纪可持续发展的需要。课题组前期筛选的菌株Klebsiella pneumoniae XJPD-Li具有在较高的温度（40℃）,较高的pH（8.0）下,高效、快速的合成1,3-丙二醇的特点。本论文通过对Klebsiella pneumoniae XJPD-Li合成1,3-丙二醇关键酶基因的克隆、表达以及定点突变,研究了甘油脱水酶高效催化的特性,得到以下结果:1.利用PCR方法从K. pneumoniae XJPD-Li总DNA中成功克隆了甘油脱水酶基因片段并构建了表达载体pET28a-dhaBCE。在1.0mmIPTG,30℃条件诱导5小时,成功表达重组甘油脱水酶。重组甘油脱水酶催化反应的最适反应温度为45℃、最适pH为8.0,比酶活为40.2U·mg-1,约为原始菌株的80倍。序列比对发现与Genbank中报道的K. pneumoniae甘油脱水酶（U60992）基因相似性为99.48%,氨基酸相似性为99.55%。2.利用大引物PCR法和质粒快速突变方法将K. pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶α亚基上差异氨基酸进行突变,成功构建了突变体M193α（S193C）、M407α（E40A）,在1.0mmIPTG,30℃条件诱导5小时条件下,M193α甘油脱水酶催化反应最适温度为45℃、最适pH为8.0,比酶活是37.8 U·mg-1;M407α最适反应温度为40℃,与原酶相比下降了5℃,最适pH为8.0,比酶活是14.7 U·mg-1,是原酶的36.6%。3.利用质粒快速突变方法,对K. pneumoniae XJPD-Li重组甘油脱水酶中β亚基上差异氨基酸进行突变。成功构建了突变体M47β（N47I）、M189β（V189I）,在1.0mmIPTG,30℃条件诱导5小时条件下,M47β和M189β甘油脱水酶比酶活分别为38.7U·mg-1和39.2 U·mg-1,与突变前重组甘油脱水酶比酶活接近。M47β和M189β甘油脱水酶最适温度分别为40℃和45℃,最适pH均为8.0,与未突变重组菌相比,M47β催化反应最适温度下降了约5度。4.利用PCR方法从E.coli K-12中成功克隆了yqhD基因并与表达载体pET28a-dhaBCE串联表达,蛋白电泳分析表明在61KD,43KD,24KD和16KD处出现特征条带。通过对Klebsiella pneumoniae XJPD-Li甘油脱水酶基因的克隆表达及其定点突变研究,为研究甘油脱水酶高效催化机理提供依据,也为甘油脱水酶定向进化提供理论指导。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-11
前言  11-12
第1章 文献综述  12-30
  1.1 1,3-丙二醇概述  12-15
    1.1.1 1,3-丙二醇的基本性质  12
    1.1.2 1,3-丙二醇的主要用途  12-14
    1.1.3 1,3-丙二醇的生产概况  14-15
  1.2 生物法合成1,3-丙二醇的研究进展  15-19
    1.2.1 生物合成1,3-丙二醇的菌种和生产能力  15-16
    1.2.2 生物合成1,3-丙二醇的代谢途径  16-18
    1.2.3 生物合成1,3-丙二醇的基因工程生产情况  18-19
  1.3 1,3-PD 生物合成途径中的关键酶  19-25
    1.3.1 甘油脱水酶的研究进展  20-22
    1.3.2 甘油脱水酶的催化机理  22
    1.3.3 甘油脱水酶的失活研究情况  22-23
    1.3.4 甘油脱水酶的克隆表达研究情况  23
    1.3.5 1,3-丙二醇氧化还原酶的研究进展  23-25
  1.4 体外定点突变技术研究进展  25-28
  1.5 论文的研究意义和技术框架  28-30
    1.5.1 论文研究的意义  28-29
    1.5.2 论文研究的技术框架  29-30
第2章 材料与方法  30-40
  2.1 材料  30-33
    2.1.1 菌种和质粒  30
    2.1.2 培养基  30-31
    2.1.3 仪器  31-32
    2.1.4 试剂  32-33
  2.2 方法  33-37
    2.2.1 细菌总DNA 的提取  33
    2.2.2 质粒DNA 的提取  33
    2.2.3 PCR 产物的回收方法  33
    2.2.4 PCR 产物与表达载体的连接  33-34
    2.2.5 热击用大肠杆菌感受态细胞的制备  34
    2.2.6 连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化  34
    2.2.7 阳性克隆的筛选和鉴定  34-35
    2.2.8 重组菌的诱导表达  35
    2.2.9 蛋白质SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳  35
    2.2.10 定点突变方法  35-37
  2.3 分析方法  37-40
    2.3.1 菌体生物量的测定  37
    2.3.2 蛋白质浓度的测定  37
    2.3.3 丙醛浓度的测定  37-38
    2.3.4 甘油脱水酶活性的测定  38-40
第3章 K. pneumoniae XJPD-Li 甘油脱水酶的克隆与表达  40-48
  3.1 引言  40
  3.2 甘油脱水酶基因的克隆与鉴定  40-44
    3.2.1 甘油脱水酶基因的扩增  41-42
    3.2.2 甘油脱水酶表达质粒pET-28a(+)-dhaBCE 的构建  42-44
  3.3 甘油脱水酶基因的序列分析  44
  3.4 重组质粒pET-28a(+)-dhaBCE 在E.coli BL21（DE3）中诱导表达  44-45
  3.5 重组甘油脱水酶dhaBCE 最适pH 值的测定  45-46
  3.6 重组甘油脱水酶dhaBCE 最适温度的测定  46
  3.7 小结  46-48
第4章 K. pneumoniae XJPD-Li 甘油脱水酶α亚基的突变研究  48-60
  4.1 引言  48
  4.2 突变设计的引物与策略  48-50
  4.3 甘油脱水酶突变体M193α的构建与验证  50-54
  4.4 甘油脱水酶突变体M407 α的构建与验证  54-56
  4.5 突变体M193α、M407α在E.coli BL21（DE3）中诱导表达  56
  4.6 突变体M193α、M407α甘油脱水酶最适pH 值的测定  56-57
  4.7 突变体M193α、M407α甘油脱水酶最适温度测定  57-58
  4.8 小结  58-60
第5章 K. pneumoniae XJPD-Li 甘油脱水酶β亚基的突变研究  60-68
  5.1 引言  60
  5.2 突变设计的引物与策略  60-61
  5.3 甘油脱水酶突变体M47β的构建与验证  61-63
  5.4 甘油脱水酶突变体M189β的构建与验证  63-65
  5.5 突变体M47β、M189β在E.coli BL21（DE3）中诱导表达  65
  5.6 突变体M47β、M189β甘油脱水酶最适pH 值的测定  65-66
  5.7 突变体M47β、M189β甘油脱水酶最适温度测定  66
  5.8 小结  66-68
第6章 dhaBCE 基因与yqhD 基因串联表达载体的构建  68-74
  6.1 引言  68
  6.2 yqhD 基因的克隆及鉴定  68-71
    6.2.1 yqhD 基因扩增引物  69
    6.2.2 yqhD 基因扩增  69-70
    6.2.3 yqhD 基因的克隆及鉴定  70-71
  6.3 重组质粒pET-dhaBCE-yqhD 的构建  71-73
    6.3.1 重组质粒pET-dhaBCE-yqhD 载体的构建  72
    6.3.2 重组质粒pET-dhaBCE-yqhD 基因的诱导表达  72-73
  6.4 小结  73-74
第7章 结论与展望  74-76
  7.1 结论  74-75
  7.2 展望  75-76
参考文献  76-82
附录A 硅胶膜质粒DNA 小量提取  82-83
附录B 多功能DNA 纯化回收试剂盒  83-84
附录C 质粒快速鉴定法筛选重组菌株  84-85
附录C yqhD 测序结果  85-86
致谢  86-87
作者简介  87-88
附表  88

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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