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基于基因打靶的绿色荧光丝转基因家蚕研究

作　者: 杨李阳
导　师: 曹广力；贡成良
学　校: 苏州大学
专　业: 遗传学
关键词: 家蚕 蚕丝 转基因 基因打靶 荧光蛋白 抗菌肽
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


家蚕(Bombyx mori)属于鳞翅目蚕蛾科,能大规模饲养,遗传背景比较清楚,其丝腺具有强大合成和分泌丝蛋白的能力。为了探索从分子改良上对家蚕进行遗传改造,本研究利用家蚕丝素轻链基因终止密码子TAA上游约1.2 kb片段和TAA下游约0.5 kb片段作为基因打靶的左右同源臂,将缺少启动子驱动的绿色荧光蛋白基因( gfp )插入到两同源臂的中间,构建获得基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。然后将该载体转染BmN细胞,通过绿色荧光检测,证明载体构建有效。通过精子介导法将该载体导入家蚕卵,首先在G0代通过绿色荧光筛选荧光蚕,由PCR结果证实所筛选出的荧光蚕为转基因家蚕;western blot检测结果显示,在G3代后部丝腺组织中可检测到分子量为70 kDa的GFP-Fib.L融合表达蛋白的特异性条带。研究结果表明通过基因打靶将外源基因导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。同时,本研究利用家蚕丝素轻链序列的第5~7外显子片段(约1.2 kb)和第7外显子及其侧翼序列片段(约0.5 kb)作为基因打靶的左右同源臂,将gfp基因和人工合成的家蚕抗菌肽基因(cec)融合克隆到两同源臂之间,并从设计上将gfp-cec基因融合到丝素轻链基因;将由ie-1驱动的DsRed基因表达盒克隆在右侧同源臂的外面,作为负选择标记,构建了在结构与功能上与上述不同的另一个基因打靶转基因载体pSK-Fib.L-L-GFP-cec-Fib.L-R-IE-DsRed-PolyA。将该载体转染细胞进行功能验证,发现转基因细胞中存在只有绿色荧光而无红色荧光的细胞,表明载体构建成功;再将该载体用精子介导转入家蚕卵,对呈绿色荧光的个体进行鉴定。初步获得了能产生绿色荧光抗菌丝的转基因家蚕。研究为探索通过分子改良,对家蚕进行遗传育种提供了新的思路。研究过程中,通过RT-PCR方法获得了家蚕JAK/STAT途径中的信号传导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)2的cDNA基因(BmSOCS-2A),测序结果表明,该792 bp片段含有完整的ORF,由4个外显子组成,编码263个氨基酸残基,分子量为28.8 kD。结构分析显示BmSOCS-2A有5个α螺旋结构,存在典型的SH2结构域和SOCS结构域。基因芯片数据分析结果显示,BmSOCS-2在家蚕雌雄性腺组织中表达量最高。进化分析表明,SOCS以不同种类聚类在一起,表明各种SOCS基因在各昆虫物种形成前就已产生SOCS基因家族。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一部分 文献综述  12-32
  第一章 基因打靶技术的研究进展  12-24
    1 基因打靶技术的发展  12-15
      1.1 基因打靶概述  12-13
      1.2 基因打靶的操作  13-15
    2 基因打靶家蚕研究的现状  15-17
    3 展望  17-19
      3.1 基于重组酶介导的位点特异性基因打靶  17-18
      3.2 基于锌指蛋白核酸酶技术的基因打靶  18-19
    参考文献  19-24
  第二章 抗菌肽的研究进展  24-32
    1 抗菌肽的抗菌机制  24-25
    2 抗菌肽的生物学活性  25
      2.1 抗菌肽的广谱抗菌活性  25
      2.2 抗菌肽具有抗肿瘤的作用  25
      2.3 抗菌肽具有促进伤口愈合的作用  25
      2.4 抗菌肽具有抗病毒的作用  25
    3 抗菌肽应用前景  25-27
      3.1 抗菌肽作为饲料添加剂  25-26
      3.2 抗菌肽作为药物载体  26
      3.3 抗菌肽可作为新型抗生药物  26
      3.4 抗菌肽作为食品防腐剂  26
      3.5 抗菌肽可对畜禽疾病的治疗与预防作用  26
      3.6 抗菌肽的转基因研究  26-27
    4 家蚕抗菌肽基因研究进展  27-29
      4.1 家蚕抗菌肽基因的研究  27-28
      4.2 已获得的家蚕抗菌肽基因  28-29
      4.3 家蚕抗菌肽基因研究的前景  29
    参考文献  29-32
第二部分 研究报告  32-82
  第三章 研究目的与内容  32-34
    1 研究目的及意义  32-33
    2 研究策略与内容  33
      2.1 轻链蛋白融合绿色荧光蛋白的基因打靶转基因家蚕研究  33
      2.2 轻链蛋白融合绿色荧光蛋白及抗菌肽的基因打靶转基因家蚕研究  33
    3 技术路线  33-34
  第四章 实验材料与方法  34-49
    1 实验材料  34-38
      1.1 培养基  34
      1.2 常用溶液及缓冲液  34-36
      1.3 SDS-PAGE 试剂  36-37
      1.4 Western blot 试剂  37-38
      1.5 生物材料  38
      1.6 工具酶、试剂盒、杂交膜  38
    2 常用仪器  38-39
    3 实验方法  39-47
      3.1 碱裂解法少量制备质粒DNA  39-40
      3.2 限制性内切酶反应  40
      3.3 连接反应  40
      3.4 CaCl_2 法制备E.coli 感受态细胞  40-41
      3.5 重组DNA 的转化  41
      3.6 家蚕细胞培养  41-42
      3.7 蚕蛾（蚕血）基因组的抽提  42
      3.8 PCR 扩增目的片段  42-43
      3.9 家蚕后部丝腺蛋白质的提取  43
      3.10 RT-PCR  43-44
      3.11 SDS-PAGE 电泳和Western blot  44-46
      3.12 缫丝  46-47
    参考文献  47-49
  第五章 Fib-L 融合GFP 的基因打靶  49-59
    1 引言  49-50
    2 材料与方法  50-52
      2.1 实验材料  50-51
      2.2 PCR 引物  51
      2.3 打靶载体pSK-FibL-L-GFP–FibL-R 的构建  51-52
      2.4 转基因载体转染BmN 细胞  52
      2.5 用精子介导法将转基因载体导入家蚕卵  52
      2.6 转基因家蚕的筛选  52
      2.7 转基因蚕的PCR 和RT-PCR 鉴定  52
      2.8 转基因家蚕丝腺表达蛋白的Western blot 检测  52
      2.9 缫丝  52
    3 结果与分析  52-55
      3.1 转基因载体的鉴定  52-53
      3.2 转基因载体的转家蚕BmN 细胞  53
      3.3 转基因家蚕的筛选  53-54
      3.4 转基因家蚕的分子鉴定  54-55
      3.5 转基因蚕茧经缫丝后的荧光鉴定  55
    4 讨论  55-56
    参考文献  56-59
  第六章 Fib-L 融合GFP 及抗菌肽的转基因家蚕  59-69
    1 引言  59-60
    2 材料与方法  60-62
      2.1 实验材料  60
      2.2 引物及PCR 扩增  60-61
      2.3 打靶载体的构建  61-62
      2.4 用精子介导法将打靶载体导入家蚕卵  62
    3 结果与分析  62-66
      3.1 打靶载体的构建  62-63
      3.2 基因打靶载体的转基因细胞研究  63-64
      3.3 融合GFP 与家蚕抗菌肽基因的转基因家蚕的获得  64
      3.4 转基因家蚕的荧光及分子生物学鉴定  64-66
    4 讨论  66-67
    参考文献  67-69
  第七章 家蚕SOCS-2 基因的克隆与序列分析  69-81
    1 引言  69-71
    2 材料与方法  71-73
      2.1 材料  71
      2.2 BmSOCS-2 基因的克隆及组织表达  71
      2.3 BmSOCS 基因的生物信息学分析  71-73
    3 结果与分析  73-77
      3.1 家蚕SOCS 基因的电子克隆及RT-PCR  73
      3.2 BmSOCS-2 基因及其编码氨基酸的结构域分析  73-74
      3.3 BmSOCS-2 基因的同源性比较  74-75
      3.4 BmSOCS-2 基因的表达谱分析  75-76
      3.5 分子进化树分析  76-77
    4 讨论  77-79
    参考文献  79-81
  结论  81-82
    1 已取得的成果  81
    2 有待进行的研究  81-82
附录一 缩略词中英文对照表  82-84
附录二 实验中使用的部分载体结构图  84-86
附录三 攻硕期间科研情况  86-87
  1 研究课题  86
  2 发表论文  86-87
致谢  87-88

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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