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核糖体基因区锌指酶位点靶向载体的构建及其打靶研究

作　者: 肖涤
导　师: 梁德生
学　校: 中南大学
专　业: 遗传学
关键词: 基因治疗基因打靶核糖体基因区靶向载体锌指酶
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

核糖体基因(rDNA)区可能是一个安全有效的基因打靶区域,我室基于此开发的非病毒人源基因载体系统——核糖体基因区靶向载体,能携带多种治疗基因在多种细胞系中成功打靶rDNA 18S区+5468位点,且外源基因能长期稳定地表达。进一步提高rDNA区的打靶效率可以更充分地发挥该区域作为基因治疗靶位点的潜能,尤其在打靶病人来源的原代细胞方面带来突破。近年来,锌指酶作为提高基因打靶效率的有力工具被广泛应用,甚至能将打靶效率提高5000倍以上。我室针对rDNA内部转录间隔1(ITS1)区+6523-+6546位点设计的锌指酶ZFN-S3,体内体外实验检测均表明其具有较高的切割双链DNA的活性。ZFN-S3可能是用于提高rDNA区打靶效率有效工具。目的：针对ZFN-S3的切割位点设计、构建核糖体基因区锌指酶位点靶向载体——pHr1-NL、pHr2-NL,证实该载体打靶rDNA区的可行性,为该载体联合锌指酶ZFN-S3高效打靶rDNA区奠定基础。方法：载体pHr1-NL的构建：首先用PCR法克隆约2kb的rDNA同源序列。然后将无启动子但5’端有EMCV-IRES序列的新霉素磷酸转移酶(Neo)基因亚克隆至同源序列的rDNA ITS1区,利用“启动子陷阱”策略富集同源重组子。并在Neo基因两侧加入同向的loxP位点,用于后续的特异性基因删除。载体pHr2-NL的构建：将pHr1-NL上rDNA+5513-+6523的同源序列替换成rDNA+937-+6523同源序列。将构建好的载体pHr1-NL、pHr2-NL利用核转染技术转染人类纤维肉瘤(HT1080)细胞,通过筛选、挑取和计数细胞克隆、鉴定定点整合等步骤,对其rDNA区的打靶进行研究。结果：1、构建的载体pHr1-NL经EcoR V、ClaⅠ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。2、构建的载体pHr2-NL经EcoR V、AatⅡ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。3、载体pHr1-NL、pHr2-NL的测序结果与理论序列相符。4、采用核转技术将pHr1-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了13个抗性克隆,并未获得定点整合克隆。5、采用核转技术将pHr2-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了12个抗性克隆,并获得了1个定点整合克隆。结论：构建的含loxP位点的核糖体基因区锌指酶位点靶向载体PHr2-NL能将Neo基因定点整合至rDNA ITS1区,为联合锌指酶ZFN-S3高效打靶hrDNA区奠定了基础。

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摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
英文缩略词表  9-11
前言  11-15
材料和方法  15-34
  1. 实验材料  15-18
  2. 实验方法  18-34
结果  34-41
  1. 实验设计  34-36
  2. 载体鉴定  36-38
  3. 细胞转染与筛选  38-41
讨论  41-44
结论  44-45
参考文献  45-48
综述:锌指核酸蛋白酶在基因编辑中的应用  48-60
  参考文献  56-60
致谢  60-61
攻读硕士期间主要研究成果  61

核糖体基因区锌指酶位点靶向载体的构建及其打靶研究

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