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肺炎支原体多抗原表位表达载体的构建与鉴定

作　者: 卢可欣
导　师: 王桂珍
学　校: 中国医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 肺炎支原体蛋白抗原基因克隆 P116
分类号: R375.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

前言肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是人类原发性非典型肺炎的病原体,无细胞壁,其引起感染的治疗与其它细菌和病毒感染有所不同,因此,Mp感染诊断意义重大。Mp细胞表面的粘附蛋白(如P1,P116等)能与宿主细胞受体结合,为Mp致病的重要因素,也是引起机体免疫反应的主要免疫原,应用重组蛋白抗原检测临床标本,有较高的特异性和敏感性。国内外已有人成功构建了Mp P1蛋白的表达载体。为了增加重组蛋白的抗原表位,提高诊断的敏感性,本研究经PCR点突变技术(TGA→TGG)获取Mp116蛋白目的基因,构建克隆载体,并与原实验室构建的PGEX-6P-1-P1表达载体重组,构建肺炎支原体多抗原表位表达载体,从克隆株中提取纯化重组蛋白,经Western blotting鉴定融合蛋白的免疫反应性,为研制更有效的肺炎支原体基因工程诊断试剂奠定基础。方法1.Mp DNA的制备按本实验室常规方法进行。2、PCR点突变扩增Mp 116目的基因根据GenBank提供的Mp 116蛋白基因(2467—3051)序列,通过引物分析软件Primer5.0和OLIGO6设计引物,上游引物序列：5’-TTTTGGATCCTCAAA GATAACATCCAAGTG-3’(BamI),下游引物序列：5’-ATATGAATTCTTGAAGCC CATGTCAGTAAAG-3’(EcoRI),突变引物序列：5’-GACCTTTGGTTGTTTAAGA TTTGGCCTAAGTTC-3’.PCR扩增突变片段,加20μM的突变引物和下游引物以及100ng模板,反应总体积50μl,95℃5min×1；95℃30s,55℃30s,72℃40s×30；72℃10min×1。回收突变片段,以此做引物扩增目的基因,加入20μM上游引物和100ng模板,95℃5min×1；95℃1min,65℃1min,72℃1min×32；72℃10min×1。1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。3、Mp克隆载体PMD-T-116的构建与鉴定将回收的目的基因和PMD-T载体连接,转入E.coli JM109。通过氨苄青霉素平板筛选阳性克隆株。质粒提取试剂盒抽提阳性克隆株的重组质粒,PCR扩增及酶切后电泳鉴定。插入的基因序列由南京金思特科技公司测定,并与GenBank提供的FH株肺炎支原体P116核苷酸序列进行同源性比较。4、Mp多抗原表位表达载体P1-P116的构建与鉴定从克隆株中提取纯化重组质粒,BamHI、EcoRI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段,与BamHI、EcoRI双酶切的PGEX-6P-1-P1表达载体(P1表达载体为EcoRI、XhoI双酶切构建)连接,转入E.coli JM109。氨苄青霉素平板筛选转化子,提取纯化重组质粒,质粒酶切图谱和PCR扩增鉴定。5、重组蛋白基因表达的检测与鉴定重组质粒P1-P116转入E.coli BL21中,将阳性克隆株培养菌液接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。离心收集菌体沉淀,转接至200ml氨苄青霉素LB中,37℃振荡培养30 min,加入IPTG至终浓度0.5mmol/L,诱导表达2h。离心收集菌体沉淀。冰裕超声破碎,离心后取上清用Glutathione Sepharose 4B纯化GST-P1-P116融合蛋白。SDS-PAGE分析表达产物的相对分子量,免疫印迹实验鉴定其免疫反应性。结果1、P116目的基因片段的扩增与鉴定PCR扩增的突变引物片段为176bp,扩增的目的基因片段为597bp,经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,扩增产物与理论值大小基本相符。2、PMD-T-116重组质粒鉴定以PMD-T-116为模板,PCR扩增出单一条带,长度与预期一致,PMD-T-116用BamHI、EcoRI双酶切,产生2.7kb和0.6kb两个片段。插入基因片段与已知的P116核苷酸序列进行比较,除突变碱基外,其余完全一致。3、Mp表达载体的构建与鉴定以重组质粒为模板,PCR扩增出单一条带,长度与预期一致。重组质粒用BamHI、EcoRI双酶切产生0.6kb和5.8kb两个片段,用EcoRI、Xhol双酶切产生0.9kb和5.5kb两个片段,用BamHI、Xhol双酶切产生1.5kb和4.9kb两个片段。4、重组蛋白抗原性检测经诱导后表达相对分子质量(Mr)为81KDa的融合蛋白,与预期的Mr大小一致。Western blotting结果显示,兔多价抗血清与纯化的融合蛋白在81KDa处形成了一条特异的抗原—抗体反应条带。结论1、本实验经PCR点突变(TGA→TGG)获取Mp 116蛋白羧基端目的基因片段。2、构建了P1-P116双蛋白多抗原表位的表达载体,转入大肠杆菌内,可稳定地表达融合蛋白。3、Western blotting证明表达的81KDa的融合蛋白具有免疫反应性。

全文目录

一、摘要  4-10
  中文论著摘要  4-7
  英文论著摘要  7-10
二、英文缩略语  10-11
三、论文  11-29
  前言  11-12
  材料和方法  12-19
  结果  19-26
  讨论  26-28
  结论  28-29
四、本研究创新性的自我评价  29-30
五、参考文献  30-31
六、附录  31-43
  综述  31-41
  在学期间科研成绩  41-42
  致谢  42-43
  个人简介  43

肺炎支原体多抗原表位表达载体的构建与鉴定

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