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悬浮芯片在病毒性出血热多重血清学诊断中的应用

作　者: 芜为
导　师: 李德新；王世文
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 免疫学
关键词: 病毒性出血热出血热病毒肾综合征兔血清血清学诊断重组核蛋白蛋白抗原登革热病人血清 ELISA 布尼亚病毒科定量检测血清标本血清稀释度病毒病抗原表达丝状病毒科新疆出血热正常人血清交叉反应
分类号: R440
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

病毒性出血热(Viral Hemorrhagic Fever, VHF)是指一类由病毒引起的,以发热和出血为主要症状的疾病。引起VHF的病毒均为有包膜的单链RNA病毒,主要包括四个不同的病毒科,即布尼亚病毒科、沙粒病毒科、丝状病毒科及黄病毒科。病毒性出血热具有较高的病死率,对人类健康及公共卫生有很大危害,全球大部分人口受到VHF的威胁。迄今,在我国流行的病毒性出血热主要有肾综合征出血热、新疆出血热、登革出血热和发热伴血小板减少综合征(SFTS)等。目前,病毒性出血热的实验室诊断方法主要有：ELISA、PCR、免疫荧光、免疫组化、病毒分离培养等,在病毒性出血热的诊断中发挥着重要作用。但上述实验室诊断方法的主要缺点在于每个反应仅能对标本的一种指标进行检测,虽然多重PCR可以一次反应检测多个病原,但是检测数量有限,不能满足高通量检测的要求,且耗时较长、成本较高、样本使用量较大。xMAP技术即多功能多指标同步分析技术,又称悬浮芯片(suspension array)或液相芯片(liquid chip)技术,是由美国Luminex公司开发的一种全新的生物芯片技术,它整合了荧光素编码微球、激光技术、微流体技术、快速信号处理和数据分析系统,提供了一个相对高通量的分子检测技术平台。本研究将xMAP悬浮芯片技术应用于病毒性出血热实验室血清学诊断中,旨在通过对病毒性出血热特异性抗体的检测,建立快速、敏感、特异、高通量的VHF实验室诊断方法,主要从以下三个部分开展工作：1、表达纯化部分出血热病毒重组核蛋白抗原构建了部分出血热病毒核蛋白的克隆,并纯化了九种出血热病毒重组核蛋白抗原。将这些纯化的蛋白进行了SDS-PAGE鉴定,纯度基本都达到90%以上。使用棋盘滴定法确定了这些重组核蛋白抗原检测相应兔血清时的最佳抗原包被量和相应兔血清中多克隆IgG抗体的滴度。2、悬浮芯片多重定量检测的质控将十种出血热病毒重组蛋白抗原分别以4μg、20μg、100μg的质量偶联荧光微球,检测兔血清后比对结果以确定最佳抗原偶联量。同时用间接ELISA法测定同批兔血清样本,研究了两种方法的相关性,证明了在一定血清稀释度范围内,两种方法高度相关。随后将十种出血热病毒重组蛋白抗原偶联的微球混合,对其中九种抗原免疫的兔血清分别进行多重荧光微球定量检测,并比较十重与单重的检测结果,以研究抗原与抗体之间的交叉反应,证明了不同种属之间的出血热病毒蛋白抗原作为检测抗原在进行血清学检测时不存在明显的交叉反应。同时检测了经亲和层析去除大肠杆菌抗体成分的兔血清,证明了血清中大肠杆菌抗体成分对结果不会造成本质影响,且影响程度与所纯化抗原纯度有一定关联。3、悬浮芯片多重定量检测临床血清标本将十种出血热病毒的重组蛋白抗原偶联的荧光微球混合,分别检测了5份肾综合征病人血清、5份SFTS病人血清及5份正常人血清,计算cutoff值,作出血清稀释度与荧光值的标准曲线,利用cutoff值计算每种病人血清样本的最低检出限及动态检测范围并评估了此方法的特异性。结果证明了悬浮芯片多重定量检测技术在检测临床血清标本上有较高的灵敏度和较广的检测范围,并且在检测感染不同属出血热病毒的病人血清时有较高的特异度。利用四重荧光微球(84FLi、L99、SFTS、Dengue)对62份肾综合征病人血清、43份SFTS病人血清、72份登革热病人血清、79份正常人血清的IgG抗体及62份肾综合征出血热病人血清的IgM抗体进行筛查后绘制ROC曲线,确定了cutoff值及其对应的敏感性和特异性。证明了悬浮芯片多重定量检测技术在筛查临床血清标本过程中具有较高的敏感性和特异性。同时将悬浮芯片技术分别与免疫层析技术、间接ELISA方法及Mac-ELISA方法作了比较,证明了悬浮芯片技术与前者在定性上的一致性较差,而与后两者在定性上的一致性较高。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-16
  参考文献  15-16
第一部分九种出血热病毒重组核蛋白的表达、纯化研究  16-47
  前言  16-17
  材料  17-20
  方法  20-31
  结果  31-42
  讨论  42-44
  小结  44-45
  参考文献  45-47
第二部分悬浮芯片多重定量检测技术的质控  47-87
  前言  47-48
  材料  48-50
  方法  50-56
  实验结果  56-79
  讨论  79-83
  小结  83-84
  参考文献  84-87
第三部分悬浮芯片多重定量检测技术在临床标本筛查中的应用  87-112
  前言  87-89
  材料  89-91
  方法  91-94
  结果  94-106
  讨论  106-109
  小结  109
  参考文献  109-112
第四部分结论  112-114
综述  114-127
  参考文献  121-127
致谢  127

悬浮芯片在病毒性出血热多重血清学诊断中的应用

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