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野生种马铃薯蛋白酶抑制剂基因CYS和API的克隆及SpCYS转化马铃薯和烟草的初步研究

作　者: 李根涛
导　师: 杨清
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: SpCYS ScCYS SpAPI ScAPI 基因克隆 遗传转化
分类号: S532
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


马铃薯(Solanum tuberosum L.)是仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。马铃薯在田间生长期间,极易受到各种害虫的侵害,造成马铃薯产量和品质的下降。因此,研究者们越来越关注如何来提高马铃薯对害虫的抗性。像其他植物一样,马铃薯也有自己的防止外源侵入的天然防御体系,蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitors, PI)正是这个体系中的一个重要组成部分。早有研究报道,植物蛋白酶抑制剂基因可以提高转化植物对害虫的抗性。现在,植物蛋白酶抑制剂基因成为在植物抗虫基因工程应用的一种重要抗虫基因。本文以野生种二倍体马铃薯Solanum pinnatisectum和S. cardiphyllum subsp为供体材料,采用PCR技术克隆马铃薯巯基蛋白酶抑制剂基因SpCYS、ScCYS以及天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因SpAP、ScAPI,并通过遗传转化获得SpCYS转基因马铃薯和烟草植株。主要研究结果如下：1.从野生种马铃薯中克隆到了巯基蛋白酶抑制剂基因SpCYS、ScCYS的cDNA全长,二者均含有705bp的开放阅读框,预测编码长234个氨基酸的蛋白SpCYS和ScCYS, SpCYS相对分子量为26.1 kD,分子式为C1153H1822N322O356S7,理论等电点为5.86。ScCYS相对分子量为26.2 kD,分子式为C1152H1825N323O356S7,理论等电点为5.91。两个蛋白的氨基酸序列中都含有在植物巯基蛋白酶抑制剂家族中高度保守的氨基酸序列L55ARFAVDEHN64、Q-X-V-Y-G (Q82TVAG86)、E105AKVWVKPW113,这是植物巯基蛋白酶抑制剂蛋白的特征序列。2.从野生种马铃薯中克隆到了天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因SpAPI、ScAPI的cDNA全长,二者均含有663bp的开放阅读框,推测编码长220个氨基酸的蛋白SpAP、ScAPI,SpAPI相对分子量为24.2 KD,理论等电点为6.39,分子式为C1082H1697N285O319S12。ScAPI相对分子量为24.2 KD。分子式为C1082H1702N286O319S12,理论等电点为6.79。3.利用半定量RT-PCR的方法对野生种马铃薯中SpCYS、ScCYS、SpAPI和ScAPI在不同器官及损伤诱导后的表达特性进行了分析。结果显示这四个基因在各个器官中都有一定的基础表达,在块茎中的表达量最高,在损伤诱导后,SpCYS、ScCYS会在3小时表达量增加,9小时达到顶峰,12小时后开始下降,与对照水平相当。SpAPI和ScAPI在3小时表达量增加,并一直保持较高表达水平,到24小时略有下降,72小时后与对照水平相当。4.使用pCAMVBIA1304载体,构建了SpCYS的过表达载体1304-SpCYS,通过农杆菌浸染法转化烟草和马铃薯,经PCR检测分别获得了2株转SpCYS烟草植株和2株转SpCYS马铃薯植株。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10缩略词及其英汉对照  10-11引言  11-12第一章 文献综述  12-32  第一节 植物抗虫基因工程研究简介  12-19    1 主要抗虫基因  12-14      1.1 Bt基因  13      1.2 蛋白酶抑制剂基因  13      1.3 植物凝集素基因  13-14    2 植物抗虫基因工程研究进展  14-17      2.1 Bt基因研究进展  14-15      2.2 蛋白酶抑制剂基因的研究进展  15-17      2.3 植物凝集素基因的研究进展  17    3 植物抗虫基因工程主要存在的问题及解决方案  17-19  第二节 植物蛋白酶抑制剂研究进展  19-32    1 蛋白酶抑制剂的类型  19-25      1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂家族  19-22      1.2 巯基蛋白酶抑制剂家族  22-24      1.3 天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂家族  24-25    2 蛋白酶抑制剂在植物中的分布  25-26    3 蛋白酶抑制剂作用机理  26-27    4 蛋白酶抑制剂的主要生物功能  27-28      4.1 植物贮藏蛋白  27      4.2 植物体本身内源蛋白的活性调节因子  27-28      4.3 植物蛋白酶抑制剂的防御功能  28    5 植物巯基蛋白酶抑制剂研究进展  28-32第二章 马铃薯巯基蛋白酶抑制剂以及天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆  32-54  1 材料与方法  32-38    1.1 材料  32-33    1.2 方法  33-38  2 结果与分析  38-51    2.1 SpCYS和ScCYS的克隆与序列分析  38-44    2.2 SpAPI和ScAPI的克隆与序列分析  44-50    2.3 SpCYS,ScCYS,SpAPI和ScAPI的表达分析  50-51  3 讨论  51-54第三章 马铃薯巯基氨酸蛋白酶抑制剂基因SpCYS的遗传转化与转基因植株的再生  54-66  1 材料与方法  54-60    1.1 试验材料  54-55    1.2 质粒提取  55-56    1.3 过表达载体的构建  56-57    1.4 农杆菌的转化  57    1.5 SpCYS转化马铃薯Desiree  57-58    1.6 SpCYS转化烟草  58-59    1.7 转基因植株分子检测  59-60  2 实验结果  60-63    2.1 过表达载体的构建  60-61    2.2 农杆菌的转化  61    2.3 转化马铃薯植株的获得  61-62    2.4 转化烟草植株的获得  62-63    2.5 PCR检测  63  3 讨论  63-66全文结论  66-68参考文献  68-80附录  80-82攻读硕士学位期间发表的研究论文  82-84致谢  84

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 薯类作物 > 马铃薯（土豆）
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