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检测牛传染性鼻气管炎抗体间接ELISA方法的建立及应用

作　者: 董华兴
导　师: 侯喜林
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛传染性鼻气管炎病毒原核表达纯化间接ELISA
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病,给养牛业造成了巨大的经济损失。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类传染病,也是我国进出境动物和国际动物贸易中规定的重点检疫对象。本试验原核表达IBRV gD蛋白,并以IBRV全病毒及gD蛋白为包被抗原建立ELISA检测方法。根据GenBankTM上公布的牛传染性鼻气管炎病毒gD基因设计一对引物,以本实验室分离的IBRV-DQ株的DNA为模板,用PCR扩增出771bp gD基因,并克隆至pMD18-T载体,再将此质粒插入原核表达载体pET30a(+)中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选阳性克隆,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE电泳检测和Western blot分析,结果表明,重组gD蛋白获得了高效表达,大小约为36kDa,且具有良好的免疫原性,可应用于IBRV抗体的检测。用长成单层的MDBK细胞增殖IBRV-DQ病毒株,并采用差速离心法浓缩,得到的病毒浓度为3.10mg/mL。以浓缩的病毒作为包被抗原,建立了IBRV间接ELISA方法,优化反应条件为抗原的最适包被浓度为1.25μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:100,酶标二抗最佳稀释倍数为1:5000,最适封闭液为5%脱脂乳。该方法具有良好的特异性和重复性,与中和试验相比较,符合率为96.25%。利用纯化后的gD蛋白作为包被抗原,建立了检测IBRV抗体的间接ELISA方法。通过方阵试验确定了gD蛋白抗原的最适包被浓度为2.5μg/mL,血清最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗最佳稀释倍数为1:5000,最适封闭液为5%脱脂乳。包被的重组抗原不与牛冠状病毒(BCV)、牛副流感病毒(BPIV)和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)的阳性血清发生交叉反应,表明建立的ELISA方法具有良好的特异性。与中和试验相比较,该方法的符合率为87.5%;与建立的IBRV全病毒ELISA相比较,该方法的符合率为92.5%。用该方法对黑龙江省部分地区采集到的863份牛血清样品进行检测,结果有710份血清为阳性,总阳性率为82.27 %,其中牡丹江地区采集的血清样本阳性率为94.79 %,黑河地区的血清样本阳性率为82.30 %,哈尔滨地区的血清样本阳性率为70.2 %,伊春地区的血清样本阳性率为74.14 %,大庆地区的血清样本阳性率为87.17 %,齐齐哈尔地区的血清样本阳性率为88.82 %。上述结果显示,建立的检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法可为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章综述  8-17
  1.1 病原学特性  8-9
  1.2 分子生物学特征  9-11
  1.3 流行病学和临床症状  11-12
  1.4 诊断  12-14
  1.5 防制  14-16
  1.6 本研究的目的与意义  16-17
第二章 IBRV-DQ 株GD 蛋白原核表达  17-28
  2.1 材料  17-18
  2.2 方法  18-23
  2.3 结果  23-26
  2.4 讨论  26-28
第三章 IBRV间接ELISA方法的建立及应用  28-43
  3.1 材料  28-29
  3.2 方法  29-31
  3.3 结果  31-41
  3.4 讨论  41-43
第四章结论  43-44
参考文献  44-48
致谢  48-49
附录  49-58
作者简历  58

检测牛传染性鼻气管炎抗体间接ELISA方法的建立及应用

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