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酵母Pub1-RRM2和RPA14的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析

作　者: 崔颖姬
导　师: 滕脉坤；牛立文
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: mRNA稳定性 mRNA翻转 RNA结合蛋白 RNA 识别结构域(RRM) Pub1 第二个RRM 晶体 RNA聚合酶 RNA聚合酶Ⅰ RPA14 RPA43
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

一、Pub1-RRM2蛋白的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析基因的表达在真核生物中是一个高度受调控的过程,主要包括转录水平的调控和转录后水平的调控。mRNA的翻转(mRNA turnover),主要通过定位于mRNA上的顺式作用元件与作为反式作用因子的RNA结合蛋白之间的相互作用来介导,它在转录后水平的调控中发挥着极其重要的作用。RNA结合蛋白是真核生物中普遍存在的一种蛋白,能特异性地与RNA或DNA结合,调控生物体代谢的多个过程,发挥着非常重要的作用。RNA结合蛋白通常含有多种不同的结构域,而RNA识别结构域(RNA recognition motif, RRM)则是其中一个非常普遍的结构域,它能够与特定的RNA或DNA序列结合来调节其稳定性,并能参与蛋白-蛋白之间的相互作用,是真核生物中一种非常重要的结构域。Poly(U)结合蛋白1[Poly(U) binding protein 1,Pub1]是酵母细胞中的一个非常重要的Poly(A) RNA结合蛋白,它在细胞质和细胞核中都有分布,并且其量在核与质中的分布没有差别。Pub1除结合poly(A)之外,还与poly(U)和poly(G)有很强的结合能力和结合特异性,故此命名。Pub1作为反式作用因子,主要通过与含有AU序列(AU-rich elements,AREs)和稳定元件(stabilizer elements,STEs)的mRNA结合来调节mRNA的稳定性,在mRNA的翻转调控中发挥着很重要的作用。此外研究还发现,Pub1除调节mRNA的稳定性之外,还可能调控其代谢的其它方面,如翻译或转运。Pub1含有三个RRMs,每个RRM都含有保守序列RNP1和RNP2,它们在结合含AREs和STEs的mRNA中发挥着重要的作用,能阻止此类mRNA的降解。但三个RRM其功能可能各不相同,而其中的第二个RRM可能特异性地结合Poly(U),并且决定整个Pub1蛋白的结合特异性。我们从酵母基因文库中克隆了Pub1的第二个RRM序列,并构建了RRM2-pET22b质粒。重组蛋白RRM-His Tag在E. coli Rosetta (DE3)中有很高的表达量,经过Ni亲和柱纯化和分子筛分离之后,蛋白的纯度达到95%以上,分子筛分析表明蛋白在溶液中以单体形式存在,且SDS-PAGE显示蛋白没有明显降解。用悬滴气相扩散法经过初筛和进一步优化后得到RRM的晶体,X-Ray衍射分辨率达到1.69 ?并进行衍射数据的收集。数据处理结果显示晶体所属空间群为H3,晶胞参数为a = b = 73.11?, c = 41.12?。分析计算和自旋patterson函数计算均表明,一个晶体学不对称单位中只含有一个蛋白质分子。以人源TIA-1的第二个RRM为结构模型,用分子置换方法进行结构解析,结构模型的精化正在进行中。二、RPA14蛋白的克隆、表达及纯化真核生物中有三种不同的RNA聚合酶,即RNA聚合酶Ⅰ,RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ。酵母细胞中的RNA聚合酶Ⅰ由14个亚基组成,核心部分含有10个亚基,当其转录特殊的rDNA时还需4个特殊的亚基,即:RPA49,RPA43,RPA34.5,RPA14。其中的RPA14和RPA43在体内易形成异二聚体,具有较高的保守性,它能与rDNA特异性的转录因子Rrn3p相互作用,召募RNA聚合酶Ⅰ结合到rDNA的启动子上,启动转录;同时RPA14/RPA43还能结合单链的RNA。RPA14缺失试验使核心酶失去转录活性,说明RPA14在RNA聚合酶Ⅰ中起到非常重要的作用,且RPA14能稳定RPA43与核心酶之间的相互作用。从酵母基因库中克隆了RPA14的CDS序列,并构建了pET22b-RPA14质粒。重组蛋白RPA14-His tag在E. coli BL21 (DE3)中表达量高,但蛋白比较难纯化,经过Ni柱亲合层析、分子筛和离子交换柱的纯化,蛋白纯度达到90%以上。对该蛋白进行了晶体生长,目前没有得到可用于衍射的晶体。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一篇 PUB1-RRM2 的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析  12-58
  第一章绪论  12-28
    1.1 mRAN 的稳定性  12-14
    1.2 RRM 结构与功能的研究进展  14-21
    1.3 Pub1 的研究进展  21-25
    1.4 Pub1 的第二个 RRM 的功能  25-28
  第二章实验材料与方法  28-37
    2.1 基因克隆和载体的构建  28-31
      2.1.1 引物设计  28-29
      2.1.2 PCR 扩增  29
      2.1.3 PCR 产物及载体的酶切、回收和连接  29-30
      2.1.4 连接产物的转化  30
      2.1.5 质粒抽提和连接产物的鉴定  30-31
    2.2 RRM2 蛋白的表达与纯化  31-34
      2.2.1 实验仪器  31
      2.2.2 实验试剂  31-33
      2.2.3 实验方法  33-34
    2.3 蛋白质序列测定  34-35
    2.4 RRM2 的晶体生长和优化  35-36
      2.4.1 实验仪器和晶体生长条件  35-36
      2.4.2 实验方法  36
    2.5 RRM2 晶体衍射数据的收集、处理和初步晶体学分析  36-37
  第三章实验结果与讨论  37-45
    3.1 RRM2 基因克隆和载体的构建  37-38
    3.2 RRM2 蛋白的表达与纯化  38-41
      3.2.1 蛋白质的预表达  38-39
      3.2.2 蛋白质的纯化  39-41
    3.3 蛋白序列测定  41
    3.4 RRM2 的晶体生长和优化  41-43
    3.5 RRM2 晶体衍射数据的收集、处理及结构解析  43-45
      3.5.1 RRM2 晶体X-Ray 衍射实验  43-44
      3.5.2 RRM2 衍射数据的处理和分析  44
      3.5.3 RRM2 的结构解析  44-45
  小结  45-46
  参考文献  46-58
第二篇酵母 RPA14 蛋白的克隆、表达、纯化及结构探索  58-77
  第一章综述  58-64
    1.1 RNA聚合酶  58-60
    1.2 RPA14 蛋白  60-64
  第二章实验材料与方法  64-68
    2.1 基因克隆和载体的构建  64-65
      2.1.1 引物设计  64
      2.1.2 PCR 扩增  64
      2.1.3 PCR 产物及载体的酶切、回收、连接和转化  64
      2.1.4 质粒抽提及连接产物的鉴定  64-65
    2.2 RPA14 蛋白的表达与纯化  65-67
      2.2.1 实验仪器  65
      2.2.2 实验试剂  65-66
      2.2.3 实验方法  66-67
    2.3 晶体生长  67-68
  第三章实验结果与讨论  68-73
    3.1 RPA14 基因克隆和载体的构建  68-69
    3.2 RPA14 蛋白的表达与纯化  69-71
      3.2.1 蛋白质的预表达  69
      3.2.2 蛋白质的纯化  69-71
    3.3 RPA14 晶体生长  71-73
  小结  73-74
  参考文献  74-77
其它工作  77-84
  一、背景介绍  77-79
  二、实验进展  79-83
  三、参考文献  83-84
附录  84-87
攻读学位期间发表的学术论文与取得的其他研究成果  87-88
致谢  88

酵母Pub1-RRM2和RPA14的克隆、表达、纯化及初步晶体学分析

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