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利用RNA瞬时干扰技术研究甘油二酯激酶基因在水稻响应激发子木聚糖酶和盐处理中的作用

作　者: 葛宏量
导　师: 章文华
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物学
关键词: 水稻甘油二酯激酶基因家族 OsWRKY71 RNA瞬时干扰 dsRNA
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


磷脂酶C(Phospholipase C, PLC)/甘油二酯激酶(Diacylglycerol kinases, DGKs)介导的信号途径是磷酸肌醇信号途径中的重要组成部分。DGK家族是PLC/DGK途径中的关键酶类,它能够迅速磷酸化甘油二酯(Diacylglycerol, DAG)生成磷脂酸(Phosphatidic acid, PA)。DAG和PA都是植物细胞内重要的信号分子,DGK对维持细胞内DAG和PA的动态平衡具有重要作用。因此,DGK基因可能在植物的生长发育,逆境与激素反应以及抗病反应等信号转导途径中起着关键的作用。而目前在水稻中关于水稻甘油二酯激酶基因家族(OsDGKs)的研究是相对欠缺的。另一方面,目前已经发现WRKY转录调控因子在植物对抗生物以及非生物胁迫方面发挥重要作用,水稻转录因子OsWRK71更是被证明参与水稻的防御逆境应答反应。鉴于上述研究背景,在本文中,为了明确OsDGKs基因家族在水稻抗逆境信号转导中的作用,我们分析研究了OsDGKs家族基因在生物胁迫(木聚糖酶处理)和非生物胁迫(盐处理)下的不同表达模式,通过半定量PCR和荧光定量PCR检测OsDGKs家族基因在以上两种逆境胁迫下的表达水平。研究发现：不同的OsDGK基因对不同的胁迫刺激呈现不同的应答模式,OsDGK1基因在木聚糖酶处理下在6小时内被快速激活,并保持长时间的高水平表达,该基因在盐胁迫下也在一定程度上被激活；OSDGK2, OsDGK3基因在两种胁迫下表现出不同的被诱导表达模式,但诱导表达水平较OsDGK1低；OsDGK7基因本底表达丰度始终较高,而且在两种胁迫处理下没有表现出明显的诱导表达趋势。研究结果初步表明:OsDGKs家族部分基因能在木聚糖酶处理和盐胁迫环境下被诱导表达,参与了水稻抗逆境胁迫信号转导途径,尤其是参与了木聚糖酶诱导的抗病防卫反应。为研究水稻OsDGKs基因家族和水稻转录因子OsWRKY71在抗逆境信号转导途径中的关系,我们建立了一个以水稻幼苗原生质体为实验材料,用于快速研究基因功能和基因之间相互作用的双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)瞬时干扰体系。研究发现：在体外转录合成以OsWRKY71编码区基因片段为模板的dsRNA,用合成的dsRNA转染水稻原生质体,再用木聚糖酶处理转染24小时后的原生质体,发现本在木聚糖酶诱导下能被激活表达的OsDGKs家族基因的表达量均有明显的下降；而用体外转录合成的以OsDGKs保守区基因片段为模板的dsRNA转染原生质体后,亦用木聚糖酶处理转染24小时后的原生质体,发现同样能被木聚糖酶激活表达的OsWRKY71基因的表达量也显著下降。而在用NaCl处理上述转染后原生质体的实验中,OsDGKs和OsWRKY71的基因表达量均与对照没有明显差异。另外,在水稻遭受病害胁迫和盐胁迫时,水稻胁迫相关基因OsNPR1、OsCIPK15均能被诱导表达,实验中,该类基因在OsDGKs多基因同时被沉默后的水稻原生质体中表达量较对照亦明显下降。根据上述实验结果推测表明：在木聚糖酶介导的水稻抗病反应中,OsDGKs与OsWRKY71之间可能存在相互调控关系；而在水稻抗盐反应信号途径中,OsDGKs与OsWRKY71可能不存在相互作用；并推测水稻OsDGKs家族基因在以上两种逆境胁迫下通过直接或者间接的方式调节胁迫相关基因OsNPR1、OsCIPK15的表达来参与逆境胁迫信号的传导途径；OsWRKY71基因可能与OsDGKs协同参与了水稻抗病反应,但不参与水稻的盐胁迫反应应答途径。在本文中,我们利用RNA瞬时干扰技术特异性干扰OsWRKY71基因和OsDGKs基因家族部分成员,盐处理干扰后原生质体细胞6小时,然后用FDA标记原生质体细胞活力,从而探讨了不同基因在盐胁迫诱导的水稻原生质体细胞活力下降乃至细胞死亡中的作用。我们优化了水稻幼苗叶、茎、根原生质体的分离和转染的方法,水稻原生质体基因瞬时干扰的方法。探索了对OsDGKs基因家族的单个基因特异性沉默和多基因同时沉默的方法,提高了瞬时干扰的效率,延长了瞬时干扰可持续作用的时间。本研究虽然没有完全阐释清楚OsDGKs基因家族和OsWRKY71以及胁迫相关基因OsNPR1和OsCIPK15在逆境胁迫下相互作用的机制,但我们建立了水稻原生质体瞬时干扰分析系统,它是特异性下调基因表达,产生类似基因敲除效果的有力工具,相对快速便捷地分析了OsDGKs基因家族和OsWRKY71在水稻抗胁迫信号转导途径中所存在的关系,为进一步深入探讨OsDGKs基因家族的功能奠定了基础。

全文目录


摘要  7-9Abstract  9-11第一章 文献综述  11-21  第一节 RNA干扰概述  11-14    1.1 RNA干扰在植物分子研究中的应用  12-13    1.2 RNA干扰的问题与前景  13-14  第二节 植物抗逆境的分子机理  14-17    2.1 植物抗病反应  14-16    2.2 植物抗盐反应  16-17  第三节 甘油二酯激酶在植物信号转导中的作用  17-19    3.1 植物DGK基因家族  17-18    3.2 PLC/DGK途径产生的PA  18    3.3 DGK基因的分子生理学效应  18-19  第四节 转录因子WRKY基因家族在水稻抗逆反应中的作用  19-21第二章 水稻甘油二酯激酶基因家族抗逆性功能初探  21-41  第一节 材料与方法  22-30    1.1 实验材料  22    1.2 实验试剂  22    1.3 水稻悬浮细胞的获得  22-24    1.4 水稻原生质体的提取  24-26    1.5 水稻原生质体的盐处理  26-27    1.6 半定量RT-PCR  27-28    1.7 Real-Time PCR  28-30  第二节 结果与分析  30-38    2.1 半定量RT-PCR检测木聚糖酶对水稻悬浮细胞中OsDGKs基因表达的影响  30-32    2.2 半定量RT-PCR检测盐处理对水稻悬浮细胞中OsDGKs基因表达的影响  32-33    2.3 Real-Time PCR检测木聚糖酶对水稻原生质体中OsDGKs基因表达的影响  33-35    2.4 Real-Time PCR检测盐处理对水稻原生质体中OsDGKs基因表达的影响  35-38  第三节 讨论  38-41第三章 RNA瞬时干扰体系的建立  41-53  第一节 材料与方法  42-47    1.1 实验材料  42    1.2 实验试剂  42    1.3 水稻原生质体的提取  42-43    1.4 Double-stranded RNA(dsRNA)的制备  43-46    1.5 水稻原生质体的RNA瞬时干扰  46    1.6 半定量RT-PCR检测RNA瞬时干扰效果  46-47  第二节 结果与分析  47-51    2.1 水稻原生质体RNA瞬时干扰体系的建立  47-49    2.2 对单个和多个OsDGKs基因的瞬时干扰  49-51  第三节 讨论  51-53第四章 OsWRKY71与OsDGKs在水稻原生质体响应木聚糖酶和盐处理中的相互关系  53-67  第一节 材料和方法  55-59    1.1 实验材料  55    1.2 实验试剂  55    1.3 基因克隆  55-57    1.4 利用RNA瞬时干扰技术分析基因之间的相互作用  57-58    1.5 利用RNA瞬时干扰技术分析不同基因在逆境胁迫诱导的原生质体细胞死亡中的作用  58-59  第二节 结果与分析  59-65    2.1 RNA瞬时干扰技术分析OsWRKY71与OsDGKs在抗逆反应中的相互作用  59-63    2.2 RNA瞬时干扰技术分析OsWRKY71与OsDGKs在盐胁迫诱导的水稻原生质体细胞活力下降以及细胞死亡中的作用  63-64    2.3 OsWRKY71的克隆  64-65  第三节 讨论  65-67本文的创新之处与不足之处  67-69  本文创新之处  67  本文不足之处  67-69参考文献  69-75致谢  75

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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