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PIH1调控核糖体RNA基因转录机制的研究

作　者: 赵忠亮
导　师: 张业；沈珝琲
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: PIH1 SNF5 Brg1 H4K16 SWI/SNF染色质重塑复合物核糖体RNA基因 RNA聚合酶Ⅰ ACF NAP-1 组蛋白八聚体染色质体外组装体外转录
分类号: Q522
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

核糖体合成是细胞生长和增殖的关键,核糖体RNA基因(rDNA)转录是核糖体合成的第一步也是其限速步骤。在哺乳细胞中,大约有400拷贝的rDNA,只有大约50%的基因处于转录激活状态,处于不同转录状态的rDNA有着不同的表观遗传修饰,包括组蛋白和DNA甲基化水平的不同,还有一个重要的区别就是核小体位置的不同。在细胞代谢、营养应激等条件下rDNA的转录需要受到迅速而精确的调控。rDNA转录沉默和转录活跃之间状态的变化,就涉及到核小体位置的变化,而核小体位置的滑动也需要染色质重塑复合物的参与。NoRC是ISWI类的染色质重塑复合物,以ATP和组蛋白H4尾依赖的方式诱导核小体的滑动。NoRC由两个亚基组成,ATP酶亚基SNF2h和大业基TIP5。NoRC抑制rDNA的转录通过诱导DNA甲基化和组蛋白去乙酰化。NoRC可以作为骨架,募集其它复合物修饰组蛋白,甲基化DNA,形成抑制的异染色质状态。然而,当细胞从静止或低能供应下恢复或者增加rDNA转录时,需要对抗上述抑制过程,并可能有染色质重塑复合物的参与,但激活rDNA转录的染色质重塑以及如何使激活复合物与组蛋白结合以对抗NoRC的机制仍不明确。我们以SWI/SNF染色质重塑复合物的核心亚基hSNF5为钓饵,从人胎脑的cDNA文库筛选出与其相互作用的核仁蛋白PIH1,并确定PIH1激活rDNA的转录。机制为PIH1通过与组蛋白H4的结合,竞争性抑制转录抑制复合物NoRC的结合,同时募集SWI/SNF染色质重塑复合物到rRNA基因启动子区,从而引起染色质活化和组蛋白修饰变化,进而引起rRNA基因转录激活。并以RNA聚合酶Ⅰ基因转录调控为模型,探讨染色质重塑复合物与组蛋白修饰以PIH I为枢纽协同调控基因转录的分子过程,为在染色质水平上为理解细胞如何应对能量、营养等环境变化提供新的信息。本研究以高糖刺激细胞为模型,通过RNA、nuclear runon、免疫荧光、染色质免疫共沉淀、体外结合实验,点突变等技术,研究rDNA转录激活的机制。结论：1、PIH1可以激活rRNA基因转录。2、PIH1的54位苯内氨酸和组蛋白H4N端16位赖氨酸结合。3、PIH1通过识别乙酰化的H4K16,从而与NoRC竞争性结合,募集SWI/SNF复合物到rRNA启动子区,引起染色质活化。本论文阐述了P1H1这种新蛋白的部分功能,首次报道SWI/SNF染色质重塑复合物可以促进RNA聚合酶Ⅰ基因转录的表观遗传调控机制。第二部分染色质体外组装和转录平台的建立真核细胞基因组DNA存在于染色质中。染色质结构是真核基因表达调控的关键。在染色质结构水平研究DNA参与的各种过程是必要的,为研究染色质结构在细胞核生命活动中的功能,必须应用体外体系将DNA模板组装成适当的染色质结构。本文通过表达纯化组蛋白特异伴侣NAP-1 (Nuclear AssemblyProtein-1)及SWI(Switching defective)/SNF (Sucrose nonfermenting)样染色质调整因子ACF(ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor),提取原核表达组蛋白八聚体和提取真核细胞组蛋白八聚体,建立了由质粒DNA、纯化的天然或重组组蛋白、重组NAP-1、重组ACF及ATP为核心成分的体外染色质组装的无细胞系统。同时利用真核细胞的核抽提物和纯化的质粒DNA进行了体外转录实验。初步建立了染色质体外组装的无细胞系统和体外无细胞转录系统。

全文目录

目录  3-7
第一部分 PIH1激活rRNA转录机制的研究  7-63
  缩写词表  7-10
  中文摘要  10-12
  Abstract  12-14
  前言  14-17
  材料方法  17-38
    一、试剂与材料  17-19
    二、菌株、细胞株和质粒  19-20
    三、主要实验方法  20-38
      (一) 感受态大肠杆菌的制备  20
      (二) 质粒DNA的转化  20
      (三) 质粒DNA的碱法小量制备  20-21
      (四) 质粒DNA的大量制备  21
      (五)琼脂糖凝胶制备及电泳  21
      (六) 限制性内切酶的酶切反应  21
      (七) 从琼脂糖凝胶中同收DNA片段  21-22
      (八) DNA片段的连接  22
      (九) 质粒定点突变  22
      (十)细胞培养  22-23
      (十一) 细胞处理  23
      (十二) 细胞冻存和复苏  23
      (十三) 质粒转染细胞  23-24
      (十四) 细胞总RNA的制备  24-25
      (十五) RT-PCR以及PCR扩增  25
      (十六) 双报告基因检测人rDNA基因启动子(pHrD-IRES-luc)的活性  25-26
      (十七) Real-time RT-PCR  26
      (十八) 染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)  26-27
      (十九) 基因组DNA的提取  27-28
      (二十) 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)  28
      (二十一) GST-PULL DOWN  28-29
      (二十二) 体外结合实验  29
      (二十三) Tandem Affinity Purificaion(TAP)  29
      (二十四) 免疫荧光分析  29-31
      (二十五) 多组织Northern膜杂交  31
      (二十六) Western印迹分析  31-34
      (二十七) 原核表达纯化组蛋白  34-35
      (二十八) 核仁提取  35-36
      (二十九) Peptide pulldown  36
      (三十) Nuclear runon  36-38
  结果  38-60
    一、PIH1—SNF5结合蛋白  38-40
      1、体内体外验证PIH1和SNF5结合  38
      2、PIH1和SNF5共定位于细胞核内  38-39
      3、PIH1的组织分布  39
      4、PIH1通过SNF5和SWI/SNF染色质重塑复合物ATP酶亚基Brg1相互作用  39-40
    二、PIH1激活rRNA基因转录  40-42
      1、PIH1,SNF5以及Brg促进核糖体RNA基因表达升高  40
      2、PIH1促进rRNA基因转录  40-41
      3、检测核仁中PIH1及SWI/SNF核心组分SNF5,Brg1的分布  41-42
    三、PIH1通过SNF5和Brg1活化rDNA启动子区的染色质状态  42-46
    四、PIH1与组蛋白H4结合  46-51
      1、PIH1与组蛋白H4结合  46-47
      2、组蛋白H4 16位赖氨酸对结合PIH1起关键作用  47-48
      3、PIH1与TIP5竞争性结合于H4K16位点  48-51
    五、PIH1 N端54位苯丙氨酸(F54)为激活rDNA转录所必需  51-55
      1、PIH1的N端61个氨基酸是其激活rDNA转录的关键部分  51
      2、P1H1 F54位点突变降低与H4结合能力  51-53
      3、PIH1点突变不影响与SNF5的结合  53-54
      4、PIH1 54位苯丙氨酸是其发挥功能所必需  54-55
    六、PIH1在高糖诱导rRNA基因转录中的功能  55-60
      1、高糖诱导pre-rRNA表达显著增加  55-56
      2、葡萄糖诱导rRNA基因启动子区染色质修饰变化  56-57
      3、葡萄糖通过PIH1促使rDNA启动子区染色质修饰改变  57-60
  讨论  60-62
  小结  62-63
第二部分染色质体外组装和转录平台的建立  63-84
  中文摘要  63-64
  Abstract  64-65
  前言  65-67
  材料方法  67-79
    一、试剂与材料  67
    二、菌株、细胞株和质粒  67-68
    三、主要实验方法  68-79
      (一) 提取核抽提物  68-69
      (二)原核表达纯化组蛋白八聚体  69-71
      (三) 提取HeLa细胞组蛋白八聚体  71-73
      (四) Sf9细胞的培养和保存  73-74
      (五) 昆虫表达纯化NAP-1  74-75
      (六) 昆虫表达纯化ACF  75
      (七) 染色质体外组装及转录  75-79
  实验结果  79-83
    1、提取HeLa细胞核心组蛋白八聚体  79
    2、NAP-1蛋白表达纯化  79
    3、ACF的表达纯化  79
    4、原核表达纯化GAL4-VP16融合蛋白  79-80
    5、原核表达纯化组蛋白  80
    6、利用纯化的蛋白进行染色质体外组装  80-81
    7、利用细胞核抽提物进行质粒模板体外转录  81-83
  小结  83-84
文献综述  84-88
参考文献  88-94
致谢  94-97
个人简历  97

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