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鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶内源性抑制剂的研究

作　者: 孙乐常
导　师: 曹敏杰
学　校: 集美大学
专　业: 食品科学
关键词: 鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶抑制剂纯化性质研究
分类号: TS254.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

鱼糜加工过程中发生的凝胶劣化现象是影响鱼糜品质的重要因素。与海水鱼相比,淡水鱼鱼糜加工更容易产生凝胶劣化。目前研究表明,鱼肌肉中含有的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)降解肌原纤维蛋白是造成鱼糜凝胶劣化的主要原因。因此,寻找一种天然有效的MBSP抑制剂来防止鱼糜的凝胶劣化,成为目前鱼糜加工技术的另一方向。近年,从白姑鱼肌肉中分离出一种内源性的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Myofibril-bound serine proteinase inhibitor, MBSPI),且与猪的GPI具有高度的同源性。关于淡水鱼MBSPI的研究尚未见报道,本研究以鲫鱼为材料,研究其肌肉中MBSP的天然内源性抑制剂,并尝试初步解释二者之间的作用机理。本试验通过缓冲液抽提、酸沉淀、离子交换色谱、亲和层析等方法从鲫鱼肌肉肌原纤维中纯化得到MBSP,并对其性质进行分析。纯化MBSP的回收率为2.4 %,纯化倍数为600倍,MBSP对胰蛋白酶类底物都有不同程度降解,其中对Boc-Gln-Arg-Arg-MCA降解最为显著,对组织蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA、氨肽酶底物Arg-MCA以及胰凝乳蛋白酶底物Suc-Leu-Leu-Val-Try-MCA与Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA均不分解作用。抑制剂试验结果显示,丝氨酸蛋白酶抑制剂对MBSP有强烈抑制,E-64对MBSP有部分抑制。以上结果说明MBSP属于胰蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶。本试验通过硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose离子交换层析、Superdex 200凝胶过滤层析得到纯化,回收率为8.0 %,纯化倍数为468倍。通过凝胶过滤测定的分子量为120 kDa,而在SDS-PAGE中,则检测到2个不同的亚基(55 kDa,65 kDa),推测其为异源二聚体结构。通过LC-MS/MS高效液相-串联质谱进行的肽指纹图谱鉴定结果显示,得到的肽段与斑马鱼gpia的同源性为91.7 %,与gpib的同源性为97.5 %。以果糖-6-磷酸(F-6-D)为底物时,GPI的Km=0.36 mmol/L,GPI的最适pH与温度分别为8.5与50℃,且在pH8.0-9.5与40℃以下较稳定。鲫鱼GPI能特异抑制鲫鱼MBSP活性,而对其它类型的丝氨酸蛋白酶以及白姑鱼的MBSP没有抑制作用。动力学实验表明GPI对MBSP属于可逆竞争型抑制,其Ki为0.075μmol/L。GPI对MBSP降解肌原纤维蛋白酶的抑制试验显示,GPI对肌原纤维的降解有较明显的抑制作用,其中肌球蛋白重链(MHC)、肌动蛋白(Actin)、原肌球蛋白(Tropomyosin)的降解都得到了有效抑制。本研究结果提示,多功能蛋白质GPI作为一种内源性的MBSP抑制剂可能对鱼体肌肉的新陈代谢起着重要的调节作用。GPI也可作为添加剂应用于鱼糜制品生产,有效抑制由MBSP引起的肌原纤维蛋白分解。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章引言  10-17
  1.1 肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶  10-11
  1.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂  11-12
  1.3 葡萄糖-6-磷酸异构酶  12-15
  1.4 本文研究目的与内容  15-17
    1.4.1 研究目的与意义  15
    1.4.2 研究内容、技术路线  15-17
第二章材料与方法  17-30
  2.1 实验动物  17
  2.2 试剂  17-18
  2.3 实验所用溶液及其配制  18-19
    2.3.1 鲫鱼肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）纯化所用溶液  18
    2.3.2 鲫鱼肌肉葡萄糖-6-磷酸异构酶的分离纯化  18
    2.3.3 SDS-PAGE 所用溶液  18-19
    2.3.4 银染色所用溶液  19
    2.3.5 Western Blot 所用溶液  19
  2.4 仪器  19-20
  2.5 实验方法  20-30
    2.5.1 蛋白质浓度测定  20
    2.5.2 SDS-PAGE 及Native-PAGE  20-22
    2.5.3 免疫交叉反应  22-23
    2.5.4 MBSP 活力测定  23-24
    2.5.5 肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶MBSP 的分离纯化  24
    2.5.6 鲫鱼肌肉MBSP 的性质分析  24-25
    2.5.7 鲫鱼葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)的纯化方案  25-27
    2.5.8 鲫鱼GPI 的性质分析  27-29
    2.5.9 GPI 对MBSP 的抑制作用  29-30
第三章结果与分析  30-49
  3.1 鲫鱼MBSP 的分离纯化与性质研究  30-34
    3.1.1 鲫鱼MBSP 的分离纯化结果  30-32
    3.1.2 鲫鱼MBSP 的底物特异性  32
    3.1.3 不同抑制剂对MBSP 的影响  32-34
  3.2 鲫鱼GPI 的分离纯化与性质研究  34-42
    3.2.1 GPI 酶活测定方法的确定  34-35
    3.2.2 GPI 纯化及分子量鉴定  35-41
    3.2.3 鲫鱼GPI 的性质研究  41-42
  3.3 鲫鱼GPI 对MBSP 的抑制作用  42-49
    3.3.1 GPI 对各种丝氨酸蛋白酶的抑制作用  42-43
    3.3.2 GPI 对鲫鱼MBSP 的抑制类型鉴定  43-46
    3.3.3 GPI 对鲫鱼MBSP 降解鲫鱼肌原纤维的抑制作用  46-49
第四章结论与展望  49-50
  4.1 结论  49
  4.2 展望  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-56
在学期间发表的学术论文  56

鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶内源性抑制剂的研究

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